【材料】

1．组织来源兔（雌性，未孕，体重2.Okg)

2．培养液及试剂DMEM/F12、胎牛血清；胶原酶I;胰蛋白酶（trypsin) ; 2001U/ml青霉素、250ug/ml链霉素，生理盐水，CMF-Hanks液，鼠抗入平滑肌肌动蛋白(a-SMActin）单克隆抗体，SABC免疫组化染色试剂盒，浓缩型DAB试剂盒。

3．仪器手术器材，C0₂培养箱，超净工作台，台式多管自动平衡离心机，倒置显微镜等。

【方法】

1．原代细胞的培养

（1)取材：兔经乌拉坦麻醉后无菌条件下取子宫，迅速置入含2001U/ml青霉素、250ug/ml链霉素的生理盐水中。于超净工作台内将子宫用已过滤的CMF-Hanks液冲洗干净。剔除外层浆膜层，纵向剪开，刀片轻轻刮去内膜，将中间平滑肌层冲洗数次，放入一无菌小烧杯中，滴少许 DMEM/F12培养液（含20％胎牛血清、2001U/ml青霉素、250 ug/ml链霉素）。

(2）消化：用眼科剪将平滑肌剪成约2～3 mm³大小的小块，组织块分别采用两种酶消化法（组织贴块法及胶原酶I消化法）。

1)组织贴块法：将组织块移入离心管，加入0.2％胰蛋白酶,0.02% EDTA混合消化液，37℃作用20分钟，再以1000r/min，离心5分钟，弃上清液，重复3次。加入完全培养液（刚浸润组织块即可），吹散，用巴氏吸管将组织小块均匀铺入培养瓶内，并直立培养瓶，加入4m1上述培养液，放入37℃,5% C0₂孵箱内（湿度在95％～100%)，干涸4～6小时后，将培养瓶轻轻放平，静置培养3小时后换新鲜培养液，以后每3天换液一次，待细胞融合成片时即可传代。

2）胶原酶I消化法：将组织块移入离心管，加0.2％胶原酶液2～3ml，盖紧管塞，置振荡仪上振荡约8～10小时（37℃,35r/min)。待90％以上的组织溶解后，1000r/min离心5分钟，弃上清液，细胞沉淀中加入新鲜配制的完全培养液，将分散的细胞重悬浮，经细胞计数，以细胞密度约3x10⁵/ml接种于50m1培养瓶中，置37℃,5% C0₂孵箱内培养，3天后换液，以后每3天换液1次，待细胞融合成片时即可传代。

2．传代培养倒弃旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶及0.02% EDTA混合液约1 ml，轻轻摇晃，使其流遍瓶底，中和残余培养液中的血清，倒掉后再加入2ml混合消化液，室温(20～25℃）消化50～90秒。镜下观察可见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽，甚至脱落下来，即加入2倍消化液体积的完全培养液终止消化。用巴氏吸管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，移入离心管，离心，重悬，细胞计数，将细胞密度调整成（2～3 )x10⁵/ml，接种于新的培养瓶中。每3天换液1次，待细胞长至融合状态后又可传代。

【结果】

1．兔子宫平滑肌细胞体外培养生长情况胶原酶I消化部分的细胞，约24小时后贴壁伸展，呈梭形或长梭形，有的细胞两端有小的分叉，约2周后细胞融合成片。

2.酶消化后组织贴块法部分的细胞，培养约8天后平滑肌细胞从组织块边缘游出，约第2周可形成明显的细胞生长晕，并围绕植块边缘呈束状向外放射延伸，细胞多为长梭形，也有三角形，椭圆形，四角形的。胞质丰富，核大清晰居中。约18天后融合成片。

3．长满瓶壁的细胞呈现火焰状或螺旋状排列，部分区域细胞可重叠生长达多层，部分区域单层，高低起伏呈典型的“峰一谷”状。

【注意事项】

1．兔麻醉比处死好，这样能保证细胞的活力。

2．取材时尽量剥离子宫以外的结缔组织，以缩短修剪时间，子宫从离体到行原代培养的时间应尽量短，以保证细胞能在最快的时间获得营养。

3．组织要尽量剪碎，植块不要太密。如果植块过大，则植块内部的平滑肌细胞因营养摄取不足而不易迁出向外生长，而如果植块过密，则细胞没有空间生长。

4．细胞营养液，用DMEM/F12培养基好，因DMEM/F12培养基Ca²⁺和Mg²⁺含量高，氨基酸、维生素和葡萄糖丰富，使细胞生长良好，并能保持原来形态和生物学特征。

5．胶原酶I的量不宜多，2～3 ml为宜，消化的程度以90％以上的组织成为均匀黏稠状混悬液为宜（不需100%)，此时已有大量平滑肌细胞解离来，且形态正常，碎片不多，成活率高。

6．培养开始时必须绝对静置3天，以免贴壁不良。

7．换液时，采取部分换液，保留1/6～1/5旧培养液，细胞状态优于全部换液的。

8．消化传代时，酶的浓度与作用时间要特别注意，浓度过高，达到适宜标准的时间就短，不易控制，而易导致消化过度；浓度过低，达到适宜标准的时间就长，易损伤细胞膜，细胞难以贴壁。经摸索，我们认为加入0.2％胰酶和0.02% EDTA混合消化液在室温下作用1分钟左右即可达到合适的消化度，细胞易被吹打下来。整个消化过程需在显微镜下密切观察。

9．要较纯的培养，关键是要将子宫的外膜和内膜剥除干净。用酶消化法，子宫内膜及外膜的消除较单纯贴块法要彻底。故我们采用这两种方法得到的子宫平滑肌细胞较纯，再经传代纯化，纯度可达99％以上。

10．传代时胰酶浓度最好为0.2%，最佳的传代消化时间为50～90秒（室温20～25℃），这样细胞刚好能从瓶壁上消化下来而不受损伤，而未消化下来的贴壁牢固的多为残余成纤维细胞，可起到纯化平滑肌细胞的作用。