内皮细胞（endothelial cell）是分布在脑、肺、肝脏、淋巴结、脾脏等器官组织中的一些有共同特点的吞噬细胞的总称，它们吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与机体免疫活动。内皮细胞扁薄，呈多边形。细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。

一、血管内皮细胞培养

血管是存在于所有组织器官的结构，血管内皮细胞（vascular endothelial cell)是构成血管与保持血管功能活动的主要部分。血管内皮细胞是常见的组织细胞培养对象之一，被广泛应用于血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等科学研究。

血管内皮细胞在形态上属于单层扁平上皮细胞，但是大血管内皮细胞与小血管内皮细胞之间存在着显著的差异。大血管如主动脉内皮细胞，主要是作为血管内衬，保证血液流动通畅，而毛细血管除完成通透功能外，尚有再生血管能力。因此，培养不同来源的血管内皮细胞，其应用价值与潜在意义不同。

（一）灌注消化法培养血管内皮细胞培养

灌注消化法能够获得纯度较高的血管内皮细胞，适用于人较大血管内皮细胞的分离和培养，故是分离血管内皮细胞的最常用方法。胎儿脐带是体外内皮细胞培养的重要来源。脐带内皮细胞易于获得、操作简单方便，培养成功率很高。

【材料】

1．组织来源从医院获得的胎儿脐静脉。

2．培养用试剂

（1）清洗液：不含Ca²⁺和Mg²⁺ PBS (CMF-PBS)。

(2）消化液：250U/ml胶原酶，用不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS配制。

3．培养基配方和制备 DMEM或M199，添加20% FBS,3.5g/L葡萄糖、2mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。调整为pH 7.2。

4．实验器材外科手术刀、眼科剪、眼科镊、解剖剪、解剖镊、止血钳和注射器、静脉留置针、培养皿和注射器。使用前用1％明胶涂培养皿底壁，置超净工作台晾干。

【方法】

1．取材 无菌操作取产后胎儿的新鲜脐带，脐带中包括一条粗大的脐静脉和两条较细小的脐动脉。选取长度为10cm、直径约5mm的脐静脉血管进行取材。如不立即培养可将脐静脉保存于4℃中，但不宜超过12小时，时间越长，越易于导致组织生理状态不良与污染。根据实验情况，可以用止血钳夹住血管的两端，将血管在70％乙醇中浸泡30秒进行除菌处理。然后，将血管的一段结扎在5m1的塑料注射器上，在解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊仔细剥除血管外膜的结缔组织，再用HBSS冲洗血管腔，使静脉腔适当扩展，并把脐带内容血污冲洗注入到废液瓶中。冲洗管腔时，如有血污堵塞可能会有阻力，不要用力过猛，以免胀破脐带。共冲洗3次。

2．消化 从血管的一端插入静脉留置针，结扎固定好，以防止液体反流。然后再用丝线将另一端也进行结扎。将消化液通过静脉留置针注入血管内，至血管充盈为止。在37℃条件下，消化10～15分钟。

3．分离细胞 切开血管的游离端，收集消化液。为获取更多细胞，可用10ml培养液冲洗血管腔2～3次，彻底清除和收集干净残余的细胞，一并注入50ml离心管中，将消化液和冲洗液1000r/min离心10分钟。

4．接种与培养弃去上清液，重悬细胞沉淀于lOml内皮细胞培养液中，用吸管轻轻吹打或摇动离心管，使细胞沉淀重悬。将细胞培养在75ml培养皿中，放入37℃培养箱内，在5% C0₂条件下培养。每隔2～3天换液1次。换液时可以弃掉1/2～2/3的培养液后，补充新鲜的培养液。待细胞生长形成单层时，进行传代培养。

【结果】

在原代细胞培养中，培养30分钟后血管内皮细胞开始贴壁，细胞初期形态不规则，可呈梭形或多角形，似成纤维细胞状；培养12小时后，可见血管内皮细胞生长增殖，细胞呈多边形或圆形，呈小簇状；培养24小时后，细胞生长形成细胞群；培养1周后，各细胞群相互融合形成培养细胞单层，细胞呈典型铺路石状排列，形态与体内血管内皮细胞相似。

【注意要点】

1．由于静脉瓣膜的存在，分离静脉内皮细胞时应注意将静脉留置针从静脉的远端插入。

2．向血管腔内注入消化液时，应防止消化液溢出，以免消化到血管外膜，引起成纤维细胞的污染与混入。

3．在原代内皮细胞培养中，如果在除去血细胞后，仍见有很多圆形小细胞，很可能是早期污染或由细菌产生的促白细胞贴附因子所致，应弃掉培养物。