成纤维细胞是结缔组织中最主要的细胞类型，具有较强的分裂、增殖能力，适应性强、性状稳定，是目前所有培养的正常人体细胞中最容易培养的细胞。人成纤维细胞培养能长期维持正常二倍体核型，对开展细胞功能性研究有很大优点和价值。体外二倍体培养细胞增殖能力有限，依据供体年龄和取材部位，人真皮成纤维细胞传代50次左右即可能出现老化。因此，在获取来自外科的组织样品时，必须了解标本来源的年龄、背景、性别、取材部位和病历等情况。

【材料】

1．组织来源手术切取患者腹部皮肤或儿童包皮环切术后包皮组织。

2．培养用试剂 消化液为HBSS液，含0.25％的Dispase Ⅱ酶,0.125％胰蛋白酶和0.1% 1型胶原酶。

3．培养基配方和制备 DMEM，高糖培养基、D-Hank's液、10％胎牛血清，人血浆纤黏蛋白干液（10umol/ml)。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪和解剖镊、培养瓶等。

【方法】

1．取材取材部位用70％乙醇擦拭消毒，由外科手术取儿童包皮。如果不能马上把标本送往实验室，置于4℃冰箱中保存，最长可保存2～3天。将包皮组织置于2.5g/L消毒液中浸泡消毒10分钟后，切除脂肪和零碎组织，剪成宽约2mm的细长条状，用HBSS漂洗两次。

2．消化4℃条件下，用0.25％的dispase Ⅱ酶消化组织10～16小时，分离表皮与真皮；真皮组织剪成约1 mm³大小，再加入30倍体积的0.1% Ⅰ型胶原酶,37℃条件下继续消化2～4小时。

3．分离细胞随时在镜下观察结果，当成纤维细胞大部分从胶原纤维中分离出来时，收集上清液。将收集的上清液进行1500r/min离心5分钟。用培养液将细胞沉淀混悬，进行1500r/min离心5分钟，重复3～4次。

4．接种与培养调整细胞浓度为2x10⁵/ml，接种于75cm2培养瓶中，置5% C0₂培养箱中，37℃条件下培养。培养24小时后更换培养液，此后隔日换液。待细胞融合至80%～90％时，0.125％胰蛋白酶消化传代。

【结果】

细胞在体外为贴壁生长型细胞。原代消化得到的细胞接种24小时内可以完全贴壁。传代后12小时大多数细胞贴壁，并伸展成长梭形，24小时内全部贴壁，48～72小时后细胞可铺满瓶底，呈漩涡状或束状。多次传代后细胞纯度增加并呈优势生长。刚接种时细胞多数呈圆形，随着时间的延长，细胞逐渐伸展呈多边形或梭形，胞质丰满，体积变大，有一个较大的扁卵圆形的核，1～2个明显的核仁。

【注意事项】

1．原代组织块培养必须使用胎牛血清（FBS)。

2．在细胞密度适度时，所有细胞生长的都很好。但在增大培养瓶时，因面积过大以容易使细胞生长缓慢或停止。

3．原代培养进行传代后，需要改换成常规的培养液。