（一）表皮角质细胞培养

表皮角质细胞是较早应用的常见细胞，不仅材料易于获得，而且具有重要的理论和实用价值。特别是在近年来组织工程研究中，表皮角质细胞已经成为皮肤组织工程的重要研究对象。表皮角质细胞的分离培养比较困难，成功率不高，主要是由于在原代培养时常常受到成纤维细胞过度生长的影响，而在传代培养后，必须采取特殊培养方法，才能维持细胞增殖，特别是多层表皮细胞的分化与形成。最常用的培养方法是饲养细胞培养法。

进行表皮角质细胞培养时，为避免受到成纤维细胞快速生长的影响，需要把表皮角质细胞从结缔组织成分中分离出来，一般是用酶消化法将表皮组织与真皮组织分开，分离出角质细胞，然后用无血清培养液进行培养或使用生长停止的饲养层细胞进行培养。

【材料】

1．组织来源早产儿或死亡胎儿的皮肤，也可用手术时取下的成人皮肤。

2．培养用试剂消化液含嗜热菌蛋白酶( thermolysin )、中性蛋白酶( dispase) ,0.2％或0.6%胰蛋白酶。

3．培养基配方和制备

(1) FAD：一种用于饲养层培养的高钙培养液，含有DMEM,Ham F12和添加物。

(2) Ham F12和DMEM混合培养液：1：3混合，含有1.8 x 10^-4 mol/L腺嘌呤,1～10ng/L EGF,O.4 ugg/ml氢化可的松、10-10 mol/L霍乱霉素、5％～10% FCS,100U/ml青霉素和50 ug/ml链霉素。

(3）角质形成细胞生长培养液（KGM)：基于MCDB153培养液配制的无血清培养液，含有低钙牛垂体提取物。为升高钙离子浓度，可加入CaCl₂。

4．实验器材眼科剪、眼科镊、手术刀、解剖剪、解剖镊、尼龙网、50m1吸管、细胞滤器。

【方法】

1．取材儿童或新生儿包皮是最常用材料；此外，也可是从外科手术时取材的皮肤组织，或取死后不超过48小时的尸体躯干皮肤等。小儿包皮来源的角质细胞在细胞贴壁和细胞增殖率方面，都具有明显高于成体来源细胞的皮肤材料。将皮肤活检材料置于聚维酮碘( Betadine）消毒液中30分钟，或者用适当加大浓度的青霉素和链霉素处理以防止污染，而不影响角质上皮细胞的活力。在PBSA中漂洗两次，每次10分钟。用植皮刀取皮肤全层皮，厚度设置在0.1～0.2mm左右，取皮后，皮下组织可用弯剪刀分离掉。用手术刀把皮切成大小约为1cmx2cm小块。用PBSA浸洗组织块2～5次。

2．消化采用胰蛋白酶消化法，可采取以下任一种方法孵育消化组织：

(1)胰蛋白酶消化法：将组织块放入含有0.6％胰蛋白酶的PBSA (pH 7.4）中，在37℃条件下消化20～30分钟。

(2）冷胰蛋白酶消化法：样品漂浮在0.2％冷胰蛋白酶中，4℃，消化15～24小时；胰蛋白酶的pH需通过观察酚磺酞变化进行监视，以免酶活性发生改变时，影响细胞的活力。

(3) dispase (Ⅱ级）消化：2.4 U/ml , 37℃条件下孵育30分钟。

(4) thermolysin嗜热菌蛋白酶）;0.5mg/ml,4℃条件下孵育12～16小时。

3．分离细胞仔细观察表皮的分离情况，当见到从皮肤样品边缘的表皮发生分离时，将组织块放入100mm塑料培养皿中，真皮侧朝下，加入5 ml完全培养基振荡。用两个细弯镊子轻轻把表皮剥下，收集至50ml离心管中，再加入20ml的完全培养基。用胰蛋白酶完成表皮分离后，用吸管从表皮上把有活力的角质细胞轻轻吹打下来，通过100 PM孔径的尼龙纱网滤过；为从表皮上用嗜热菌蛋白酶或dispase消化下单个细胞，还需要再用0.2％胰蛋白酶和0.5% EDTA孵育10分钟。用培养基漂洗分离的表皮细胞2次，进行500r/min离心10分钟，计数细胞总数和不吸收锥虫蓝的活细胞数。

4．接种与培养用KGM或FAD培养基培养，可以适当的细胞密度接种细胞：

(1)在细胞培养3天前，预接种已用丝裂霉素或射线处理制备的饲养细胞，然后以（2～5)x100个／cm²密度，接种培养角质上皮细胞。

(2)用高密度接种初代角质细胞（1x10⁵～5x10⁵/cm²）于FAD中，并在传代时保持高细胞密度，以抑制或排除培养中成纤维细胞的过度生长的影响。

5．传代培养

(1)将细胞孵育在0.05％～0.1％的EDTA中5～15分钟，使细胞脱壁，镜下可见细胞间出现缝隙，细胞变圆。在1.3 mmol (0.05%) EDTA和0.1％胰蛋白酶中，37℃条件下孵育5～10分钟，随后轻轻吹打使细胞从培养瓶彻底脱离。

(2）因KGM中钙浓度低，不需要用EDTA处理；与用FAD培养的细胞一样，在1.3 mmol的EDTA和0.1％胰蛋白酶中孵育。

(3）离心（1500r/min,10分钟），弃去上清液，加PBSA漂洗，离心吸去上清，加FAD培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，以适当的细胞密度接种培养。

【结果】

培养1～3天后，细胞贴壁。人表皮角质细胞培养2～7天后开始增殖，形成集落并向四周扩散。细胞贴壁后，细胞充分浸洗在培养液中，用以去除未分化的细胞和未贴壁的死细胞。然后，加入KGM或FAD，继续培养。可通过调整KGM的钙离子浓度促进细胞角化和减慢生长。细胞呈多角形，如砌石状排列。在细胞质内可见张力丝构造，在细胞层上可能散在有黑素细胞。但在成纤维细胞层中几乎看不到此类细胞。

【注意事项】

1．应取尽量新鲜的皮肤材料，最好来源于年轻人体。

2．消毒处理时要彻底，可使用乙醇等消毒剂需要到达皮脂孔或汗腺等部位，并停留一定时间。

3．表皮与真皮的分离步骤很重要，可能会影响细胞纯度。