【材料】

1．材料来源手术切除的正常人肠组织。

2．培养用试剂

(1) TE液：Tyrode液加入2mmo1/L EDTA, Tyrode液含2.7mmol/L KC1,137mmol/L NaC1,0.36mmo1/L NaH₂P0₄和5.55 mmol/L葡萄糖。

(2) TEA液：TE液加入20O ug/ml氨苄西林、200 ug/ml庆大霉素和40 ug/ml甲硝唑。

(3) TGMD液Tyrode也加入0.1％明胶、15mg/L DNA酶和1.23mmol/L MgCl₂。

(4) HA液：HEPES液，添加0.25g/L不含脂肪酸的BSA。 HEPES液含20mmol/L HEPES,5mmo1/L KC1,125mmol/L NaCl和0.5mmol/L葡萄糖。

(5）HACM液：HA液补充1 mmol/L MgCl₂和lmmol/L CaCl₂。

(6）消化液a用TE液配成，含有0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶和3g/L链霉蛋白酶。

(7)消化液b用TGMD液配成，含有0.15g/L弹性蛋白酶和1.5g/L胶原酶。

（8）1g/L乙酰半胱氨酸溶液，用TE液配成。

(9) Percoll溶液：密度为1.037g/ml。

3．培养基配方和制备不含酚磺酞的RPMI 1640，添加10% FBS,25mmol/L HEPES,50ug/L SCF,l00U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科镊、眼科剪、手术刀、解剖剪、解剖镊和止血钳。

【方法】

1．取材取肠组织10～40g，用预冷的TEA液清洗。用眼科剪分离黏膜下层与肌层。将黏膜层和黏膜下层切成大小约lcm²的小块，放入乙酞半胱氨酸溶液中，室温下浸泡10分钟，去除黏液。将组织块放入5mmol/L EDTA的 TEA液中，然后在培养箱内放置15分钟，以除去上皮细胞。

2．消化用TE液充分冲洗组织块，然后将组织块剪碎，放入消化液a中，室温条件下消化30分钟。用300 um孔径的不锈钢筛网滤去已脱落下来的细胞。用TE液清洗，然后用消化液a将组织块重复消化1次。将组织块用TGMD液清洗后，放入消化液b中，30℃条件下消化30分钟。

3．分离细胞用300 um孔径的不锈钢筛网滤出组织块，收集滤液，在4℃条件下进行1000r/min离心10分钟。弃去上清液，用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下保存。重复操作1次，得到细胞悬液。用100 um孔径的不锈钢筛网过滤。收集滤液，在4℃条件下进行1000r/min离心10分钟。

4．接种与培养用HACM液混悬细胞，进行细胞计数，调整细胞密度为(0.5～2)x10⁶个／ml。在50ml离心管中加入20ml浓度为1.037g/ml的Percoll溶液，将细胞悬液加于Percoll溶液表面上，然后在20℃条件下进行 1000r/min离心15分钟。用HA液混悬沉淀细胞，在4℃条件下进行1000r/min离心10分钟，然后重复离心1次。用培养液混悬沉淀细胞，进行细胞计数，调整细胞密度为（0.5～2)x10⁶个／ml，放培养箱中培养。24小时后更换培养液，以后每周换液1次。

【结果】

每克肠黏膜层和黏膜下层可获得2x10⁷个细胞，其中肥大细胞约有5x10⁵个。在培养过程中，淋巴细胞和成纤维细胞逐渐死亡，肥大细胞的纯度则不断得到提高。肥大细胞可培养至160天以上。

【注意要点】

将细胞悬液加至Percoll溶液表面时，动作要慢，以免影响肥大细胞的纯化。