骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架或称细胞外基质上，使细胞在预制形态的三维支架上生长，然后将这种细胞杂化材料植人骨缺损部位，细胞在机体内继续增殖，而生物支架结构则逐渐被降解、吸收，结果形成新的有功能的骨组织，从而达到修复骨组织缺损和恢复骨功能的目的。近年来，从自体或异体取材的骨细胞在体外培养后，已经成为用于组织工程的材料。

一、软骨细胞的分离和培养

软骨由软骨膜、软骨细胞及软骨基质构成，软骨细胞是软骨组织的主要细胞成分，在软骨的生长及功能代谢中起着重要作用。软骨属于再生能力很弱的结缔组织，组织中血管很少，细胞稀疏，而且细胞分裂活性很低。根据软骨组织内所含纤维成分的不同，可将软骨分为透明软骨、弹性软骨和纤维软骨三种，其中以透明软骨的分布较广，主要分布于关节软骨、肋软骨等，结构也较典型。从软骨组织中分离获得的软骨细胞能够在体外合适的环境或载体材料中进行有丝分裂，并分泌细胞外基质，重新形成软骨样组织。软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同导致所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞的体外增殖能力随传代次数增加、培养时间延长而呈现明显下降趋势。如果没有生长因子的刺激，一般传6～8代后已很难增殖，基本丧失软骨形成能力。

（一）耳软骨的分离培养

【材料】

1．组织来源年龄10～20岁的耳畸形患者手术过程中废弃的残余耳软骨碎片。

2．培养用试剂

（1) PBS：高压灭菌备用，使用前加入100U/ml青霉素和l00 ug/ml链霉素。

(2）胶原酶（II型）：用无血清F-12培养液配制成3mg/ml，浓度为0.3%，通过0.22 um消毒滤器过滤。

(3) 0.4％锥虫蓝：用时稀释成1:10，用PBS配制。

(4)蛋白酶/EDTA消化液：胰蛋白酶用PBS配制成0.25%，加入EDTA 0.2g/L，搅拌均匀后调节至pH 7.4,0.22um消毒滤器过滤。

3．培养基配方和制备Ham F12培养液加入10％的胎牛血清（FBS) ,300ug/ml L-谷氨酰胺、50ug/ml维生素C,100U/ml青霉素和l00ug/ml链霉素，0.22 um消毒滤器过滤。

4．实验器材外科刀柄、刀片、培养皿、培养瓶、称量瓶、过滤器和离心管。

【方法】

1．取材术中获取的软骨组织保存在4℃无血清的Ham F12培养液中，送至实验室。PBS反复冲洗，倒入培养皿中。在超净工作台内用血管钳剥离软骨表面致密的软骨膜，再用剪刀将残余的软骨膜彻底去除，PBS反复冲洗。耳软骨为淡黄色不透明，具弹性。软骨组织用剪刀剪成lmm³大小的组织块，用PBS清洗后称重。

2．消化加入3～5倍软骨体积的胶原酶，胶原酶浓度调节为0.05%，置于37℃恒温摇床内振荡（80次／分钟）消化16小时。其中，每隔8小时过滤离心收集软骨细胞1次。

3．分离细胞以150目筛网过滤去除碎屑及未消化的软骨碎片，滤液进行1500r/min离心5分钟，弃上清液，管底沉淀细胞用PBS悬浮，离心洗涤3次，去除残余胶原酶。

4．接种与培养

(1)软骨细胞的原代培养：

1)加入Ham F12培养液，混合均匀后制成细胞悬液，锥虫蓝染色观察细胞活力并计数。

2）按细胞浓度为2x10⁴/cm²用培养液进行稀释，刻度吸管吹打使细胞混匀。

3)每3天更换一次培养液，培养7～10日，培养皿中细胞基本融合，即可传代。

(2）软骨细胞的传代培养：

1)用刻度吸管吸去培养液，加入PBS 10m1，清洗2遍。吸去PBS后加入0.25％胰蛋白酶4m1,37℃放置2分钟。待细胞变圆形、浮起，加入含血清的培养液8m1，终止消化。

2）收集细胞到离心管内，进行1500r/min离心5分钟，吸去上清液。加入10m1 PBS,漩涡振荡器内混匀，再进行1500r/min离心5分钟，弃上清液。最后向离心管内加入Ham F-12培养液10ml，均匀制成细胞悬液。锥虫蓝染色观察软骨细胞活力，血细胞计数板计数。

3）将培养液稀释，按原代细胞密度接种至10cm培养皿内。

【结果】

活力良好的原代细胞在培养6～8小时开始贴壁，24小时基本完成贴壁，贴壁后细胞开始伸展，形态逐渐由圆形向多角形转变，集落生长。8～10日形成单层细胞，细胞排列紧密，折光性强。传代细胞第1～3代细胞呈多角形，小部分细胞形态变狭长。第4代开始细胞体积变大，呈长梭形，向成纤维细胞形态转化明显，细胞达到融合状态的时间也逐渐延长。第6～8代以后，细胞增殖能力迅速下降，细胞间隙变大，胞膜境界不清，呈长梭形。

【注意事项】

1．取材时严格无菌操作，剥离软骨膜时间不宜太长。如细胞在24小时内不贴壁，提示可能发生了污染。

2．软骨细胞接种密度低时，多呈成纤维细胞形态，并且其增殖速度明显低于接种密度高的软骨细胞。

3．已取到的组织标本，需要置于4℃保存，并在2～4小时内利用。

4．软骨细胞包埋于致密的糖蛋白基质中，必须用酶消化法去除基质才能获得游离的细胞。但细胞对胶原酶敏感程度差别很大，如酶浓度过高或消化时间过长则影响细胞贴壁。

（二）。关节软骨的分离培养

【材料】

1．组织来源孕20～24周自然流产胎儿的股骨和胫骨。

2．培养用试剂

（1）PBS：含有100U/ml青霉素，100 ug/ ml链霉素，pH 7.2。

(2）消化液：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml胶原酶混合液，用PBS液配制。

（3）胶原酶：0.5 mg/ml。

3．培养基配方和制备DMEM培养液，含有10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml、两性霉素2.5 ug/ml、谷氨酰胺2mmo1/L, 1％维生素添加剂以及维生素C 50ug/ml。

4．实验器材手术器械、过滤器、培养皿、培养瓶、称量瓶和离心管。

【方法】

1．取材从自然流产胎儿的股骨头和胫骨坪切取骺软骨。用PBS液洗净数次，尽量除去纤维性组织，注意无菌操作。

2．消化将软骨放入胰蛋白酶、胶原酶混合液中，置于37℃孵育1小时；弃掉消化液，将软骨块充分切碎，加入胶原酶，在37℃孵育过夜。

3．分离细胞加入培养液终止消化，用过滤器过滤。再进行500r/min离心5分钟，弃上清液。用培养液将细胞团吹散，重新悬浮细胞，离心，重复3次。用培养液将最后得到的细胞团制成悬液。

4．接种与培养接种到培养皿内，置于37℃,5% C0₂饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。