胰岛是胰腺的内分泌部分，由许多大小不等和形状不定的细胞团组成，散布在胰的各处。成人胰腺约有100万个胰岛，约占整个胰腺体积的1％～2%。人类的胰岛细胞按其染色和形态学特点，主要分为A细胞、B细胞、D细胞及PP细胞。大多数为产生胰岛素的B细胞，它们位于胰岛的中心部分，占胰岛细胞的60％～70%，分泌胰岛素。而胰岛的周边部分大多是能合成胰高血糖素和生长抑素的A细胞和D细胞，约占胰岛细胞的30%。很少量能分泌胰多肽的细胞则分散在胰岛内部。

胰岛细胞移植作为一种极具潜力的糖尿病治疗手段而成为目前研究的热点，但供体细胞来源仍为胰岛细胞移植中P待解决的难题。目前在体外培养的细胞模型系统有两大类，一是从肿瘤细胞组织克隆产生的胰岛细胞系，二是从胰岛组织分离的胰岛。前者虽可获得同源细胞成分但对生物刺激反应弱，不能如实反映生物体功能。后者更接近机体生理状态，但可获得的组织量少，有效期短且不好掌握，尤其人胎胰腺来之不易。以下主要介绍人胎胰岛细胞的体外分离培养方法，为在体外观察胰岛B细胞的功能及多方位地研究糖尿病的发病机制提供了一个良好的实验工具。也在胰岛细胞的增殖、代谢以及胰岛移植的应用等方面具有广泛的价值。

【材料】

1．组织来源胎龄20周左右的流产胎儿。

2．培养用试剂

（1）RPMI 1640培养液或TC 199培养液。

(2) V型胶原酶。

(3）D-Hanks液。

(4）中性蛋白酶n。

3．培养基配方和制备培养液RPMI 1640培养液或TC199培养液，含10% FCS,100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

4．实验器材吸管、试管、离心管、剪刀、手术刀、20ml注射器、培养瓶或培养皿若干。

【方法】

1．取材取材过程需注意无菌操作。取回刚刚流产的胎儿，用碘酒、乙醇消毒腹部皮肤。切开腹部皮肤，打开腹腔，找到胰腺。用无菌钳轻轻提起并小心地进行胰腺后剥离，放入盛有D-Hanks液的无菌平皿中备用。宜于娩出后2小时内无菌取出胰腺。

2．消化将组织置于冰冷D-Hanks液（内含100U/ml青霉素和l00 ug/ml链霉素）洗涤数次。用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管和结缔组织等胰外组织。用剪刀将胰腺组织剪成2～3 mm³大小的碎片。将组织碎片放入一无菌瓶中，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗，V型胶原酶消化5～10分钟，加入冷D-Hanks液终止消化。再用中性蛋白酶Ⅱ消化5分钟左右再用冷的D-Hanks液终止消化。

3．分离细胞细胞消化液1500r/min离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks液悬浮，离心（1500r/min, 10分钟），重复1～2次，再用培养基洗2～3次，用含10% FCS的RPMI 1640培养液悬浮细胞沉淀，制成细胞悬液。取一定量的细胞悬液，用0.4％锥虫蓝染液染色，观察细胞活性并进行细胞计数。

4．接种与培养调整细胞浓度为2 x 10⁵/ml，接种到培养瓶中，置于37℃ ,5% C0₂饱和湿度细胞培养箱中培养。在胰岛细胞原代培养的最初2～3天内，在培养瓶中出现大面积的融合的成纤维细胞。在成纤维细胞层上逐渐出现了球形的细胞聚集物，轻轻将细胞从附着物上吹下，离心后加入新的培养液，调整细胞浓度接种到另一新的培养瓶中。于37℃,5%co₂孵箱中继续培养，培养第3～4天换液1次至胰岛细胞充分展开形成良好的细胞单层。

【结果】

1．培养结果培养12～24小时胰岛细胞开始贴壁，培养第2～3天细胞处于快速生长期，可见多数细胞呈圆形或多边形，大多数体积较小，排列紧密，也有的体积较大胞质丰富，细胞核与核仁明显，有时还可见到导管样结构。细胞膜完整，细胞折光性好。随着培养天数增加，贴壁不牢的细胞及悬浮细胞逐渐增多，细胞形态及结构开始紊乱，细胞生长基本停滞。

2.胰岛细胞的鉴定

(1)胰岛素水平的测定：在细胞培养的第3 ,5 ,7天吸取培养瓶中少许上清，测定出上清中有高浓度的胰岛素水平。随着培养时间延长，胰岛素水平有增高的趋势。

(2）免疫荧光检测胰岛细胞：将培养细胞进行涂片、固定，用D-Hanks液洗涤数次。滴加荧光素标记的羊抗人胰岛素抗体，孵育。用荧光显微镜观察，可见到荧光反应阳性的胰岛细胞。

【注意事项】

1．取胰腺标本时要尽量迅速，尽可能地剔除脂肪、淋巴及肠系膜血管等组织，因为它们修剪的彻底与否直接影响消化程度的判断。

2．消化程度决定着胰岛细胞的产量和纯度。如果消化不足，胰岛细胞不能完全从胰腺组织中游离出来，即使游离出来，其表面所黏附的外分泌腺泡液也将使胰岛细胞密度改变，而得不到很好的纯化；如果消化过度，游离下来的胰岛细胞会遭到胶原酶或源于外分泌组织中毒性物质的继续作用而造成结构和功能的损害，因此消化程度的掌握至关重要。原代培养制备细胞悬液时最好选择2步法进行消化，将前期消化出的细胞及时转入培养基中给予保护。根据胎胰的胎龄大小调整消化时间。在消化过程中应密切观察组织与消化液pH的变化，及时终止消化，以防消化过久而导致细胞破碎。

3．在消化好的胰岛细胞悬液中会混有部分成纤维细胞。为减少成纤维细胞的污染，传代时仅重新接种从原代培养物表面吹打下来的细胞。