机械法体外分离山羊胚胎干细胞，将其接种在经丝裂霉素灭活的小鼠成纤维细胞或STO饲养层上。分离的山羊胚胎干细胞具有胚胎干细胞的活性，表达胚胎干细胞相关蛋白Nanog, Oct4和SSEA-3。

【材料】

1．组织来源孕6～7天关中奶山羊，STO细胞为饲养层。

2．培养用试剂

（1）冲胚液：DMEM培养液，含10% CS和25 mmol/L HEPES (pH 7.4)。

(2）消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液，无钙镁PBS配制，pH 7.40

（3)丝裂霉素C储存液（0.5～1.0g/L,PBS配制）。

3．培养基配方和制备DMEM培养基含有20% FCS,0.102g/L胰岛素、0.11 mmol/L β-琉基乙醇,100U/ml青霉素和100 ug/ml链霉素。

4．实验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、玻璃微针、离心管、手术刀片。

【方法】

1．取材取受孕6～7天胚胎，手术法采集胚胎，PBS冲洗3次。将囊胚放入铺有饲养层细胞STO的4孔培养板上（经过丝裂霉素C预处理），每孔1枚，每孔加5m1 ES培养液，置37℃,5% C0₂饱和湿度的培养箱中培养。培养4～5天后，选择生长集中、隆起明显、形态仍未分化的ICM集落，玻璃微针拨动内细胞团，使其与滋养层细胞分离。

2．消化Hanks液洗细胞团2次，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加ES培养液终止反应。

3．分离细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。

4．接种与培养细胞计数，将细胞以3x10⁶个／ml接种至新制备预先铺有饲养层细胞的4孔培养板上，置37℃,5% CO₂饱和湿度的孵箱中培养。如此每隔2～3天重新传代1次。

【结果】

分散的内细胞团培养3～6天后，可见许多细胞集落，细胞折光性强。随着培养时间的延长，集落体积逐渐变大。山羊ES细胞体积较小，细胞核较大，核仁明显，胞质较少。细胞之间界限不清晰，紧密聚集呈鸟巢状克隆。并且根据细胞碱性磷酸酶呈阳性、细胞表面SSEA-1的表达进行鉴定。

【注意事项】

1．山羊囊胚在饲养层不易形成ESC样集落，1CM可形成ESC样集落。

2．选择生长集中、隆起明显、形态未分化的1CM集落，分离细胞。