一、肝癌细胞

原发性肝癌细胞原代培养可使肝癌细胞最大程度地保持其在体内的各种生物和遗传学特性，有利于对肝癌的发病机制及其防治进行研究。

【材料】

1．取材后的肝癌组织。

2. RPMI1640,Hanks液、胎牛血清、胶原酶。

3．眼科剪、眼科镊子、玻璃吸管、注射器、平皿、离心管、200目筛网、培养瓶等。

【方法】

1．将肝癌组织块置于平皿中，加入Hanks液，用眼科剪将不需要的血块和组织（坏死组织或结缔组织等）除去，再用Hanks液洗2遍，剪成lmm³的小块。

2．加入少量Hanks液，用注射器芯将肝癌组织轻轻研磨碎，用玻璃吸管将组织块移入离心管，反复吹打后，用200目不锈钢筛网过滤。

3．低速离心后，加入RPMI 1640培养液重悬细胞后，接种于培养瓶中培养。

【结果】

肝癌细胞培养时，细胞在培养10小时可贴壁，24小时后可见有生长，3天后部分形成单层，约一周左右可长满瓶底。原代培养中常见有正常成纤维细胞混杂生长。

【注意事项】

分离肝癌细胞时，也可在肝癌组织研磨后，加入胶原酶消化，然后获得细胞悬液，再进行过滤离心。可去除混杂的纤维细胞。

二、胃癌细胞

胃癌是全世界致死率占第二位的癌症。来自胃癌的细胞系是研究胃癌细胞生物学及新型治疗方式的发生、发展和检测的有力工具。临床上常见的胃部取材方法主要分两种，一种是胃镜下直接取胃实体组织取材，另一种就是在发生胃癌转移时，通过抽取腹水或者胃冲洗后，采集的液体进行梯度离心后收集细胞进行培养。这里我们分别介绍包括原发病组织取材和通过腹水分离两种胃癌细胞的原代培养方法。

（一）实体瘤的培养

【材料】

1．胃肿瘤组织、含10％胎牛血清的RPMI 1640, PBS、抗生素（青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)。

2．培养皿、眼科剪刀、眼科镊子、玻璃吸管、培养瓶（铺被了胶原和层粘连蛋白等黏附因子）、离心管。

【方法】

1．将癌组织移至加了无菌PBS的培养皿中，冲洗血液及黏液等，用剪刀和镊子剔除坏死区、脂肪组织、血凝块和结缔组织。

2．将洗净的癌组织移至新培养皿中，用眼科剪刀将癌组织剪成细小碎块。

3．将组织碎块中加入10ml PBS，用玻璃吸管使劲吹打，使小块组织的细胞分离并聚集。

4．静置片刻，使大块因重力沉降至底部。

5．用玻璃吸管小心收集上层肿瘤细胞团块，转移至15 ml离心管中，低速离心后弃上清液。再用PBS重悬，离心、洗涤一遍，弃上清液。

6．用5 ml起始培养液重悬细胞。将细胞团块移至25cm²培养瓶中。盖上瓶盖，置37℃,5% CO₂的培养箱中培养。

（二）腹水培养

腹水的处理过程应根据腹水的体积和所含的细胞种类（红细胞、间皮细胞；单核细胞、肿瘤细胞）而定。对于红细胞很少或没有红细胞的样本，细胞经离心后，用RPMI 1640培养基重悬，无需其他处理，接种到25cm2培养瓶即可。对于含有大量红细胞的样本，细胞经Ficoll/metrigoate离心后，以RPMI 1640培养基重悬。

【材料】

1．含10％胎牛血清的RPMI 1640 , Ficoll/metrigoate，如淋巴细胞分离液1.077g/ml,PBS。

2．培养瓶、1 ml移液器、玻璃吸管。

【方法】

1．在15 ml无菌离心管中加7ml Ficoll/metrizoate。在7m1 Ficoll/metrigoate液表面用吸管将等量稀释后的腹水沿管壁轻轻地加于Ficoll之上。

2．用台式离心机以1500r/min，离心30～40分钟。

3．用吸管小b吸走上层液，在上层液与Ficoll的交界面上保留癌细胞层，勿搅。将癌细胞层移至另一洁净离心管中。

4. Ficoll缓冲液底部的细胞团常含有相当量的肿瘤细胞团块，用PBS洗一次后，用PBS重悬，室温静置，使较重的细胞团靠重力沉降。上清液中含有大多数的红细胞，吸走上清液后，收集细胞团。

5．向离心管中的癌细胞加3倍体积的PBS。用吸管轻轻吸、吹，重新悬浮细胞；用1500r/min，离心10分钟，弃上清液，加10m1 RPMI 1640，用吸管重悬细胞，然后再用800r/min，离心10分钟。重复上述洗涤步骤。

6．弃培养基，用5 ml HPMI 1640完全培养液重悬细胞。将细胞接种到25cm2培养瓶中。盖上瓶盖，置37℃,5% C0₂的培养箱中培养。

【结果】

能成为连续细胞系的可认为是来源于肿瘤细胞，因为正常胃上皮不会永生化。形成聚集体的能力表明细胞能悬浮生长，也表明了细胞的肿瘤源性。胃癌细胞可以以细胞浮团生长；以紧密或疏松黏附的集落生长；或以黏附和悬浮两种亚群生长。从中等分化肿瘤来源的细胞系SNU-216，以大片岛状单层弥散生长。体外多数细胞贴壁生长。来源于原发瘤的SNU-484细胞系呈低分化腺癌伴中等结缔化，以贴壁亚群和悬浮亚群混合生长，细胞密度不均一。SNU-520来源于分化差、间质少的腺癌，以单个细胞或细胞球样聚集体，呈游离悬浮生长。单个细胞呈圆形或椭圆形，核质比例较高。聚集的细胞围绕细胞间隙呈极性排列。聚集细胞侧壁间复合连接很明显。