细胞培养已成为研究癌症的发病机制和肿瘤细胞生物学特性的常用方法。细胞培养提供的模型系统中，实验变量可被严格控制，较使用整体动物更省时、价廉且易于操作。在基础研究领域取得的理论和技术进展的基础上，细胞培养体外系统为肿瘤研究提供了新的方法和应用领域，体外研究结果也为进一步的体内研究提供可借鉴的资料。细胞培养技术的进一步发展，将为细胞恶变机制研究提供新的平台，并将促进肿瘤的基础研究与临床防治研究。本章主要介绍肿瘤学研究和临床实践中涉及细胞培养的一些成熟技术方法。关于肿瘤的生物治疗技术，早在1985年美国国家癌症中心已经将生物治疗正式列入肿瘤综合治疗的第四大模式。生物治疗从临床上广泛应用LAK,TIL细胞开始出现“火热”，中间曾由于滥用现象而走入过一段低谷，发展到今天又迎来了一个应用CIK细胞的高潮。由于过继免疫治疗的优点决定了它在肿瘤生物治疗中的地位，因为肿瘤特异性抗原的研究仍未取得实质性的突破，肿瘤疫苗和靶向治疗制剂的使用仍难达到理论上的期望值，恐怕过继免疫治疗在今后一段时间里仍将是肿瘤生物治疗中最重要的手段。关于LAK, TIL与CIK细胞的制备与功能检测等。

第一节恶性转化细胞的诱发和培养

癌变，即细胞恶性转化，是一个发生在体内的过程，在体外细胞培养条件下，也可以用人工方法诱发。人工诱发体外培养细胞的转化，是研究癌变原理的重要方法，其优点是重复性好，可用于研究各种可致癌因素的作用，细胞发生转化后，能够进行直接观察和做各种分析。人工诱发转化产生的体外癌变模型，不仅在理论研究中有重要作用，亦可应用于检测环境中的致癌物。

一、人工诱发细胞恶性转化

在细胞培养条件下，用化学、物理和生物等各种致癌物可人为地诱发细胞发生恶性转化。条件是要让细胞直接受到致癌物的作用，从细胞接触致癌物到发生恶性转化一般需两周到三个月的时间。

（一）细胞转化基本过程

1．诱发也称启动，是致癌物或诱变剂诱发DNA损伤的过程。诱发因素可分为物理因素，例如，射线；化学物质，即致癌化合物以及生物因素，例如某些病毒（EB病毒、人乳头瘤病毒等）、黄曲霉毒素等。应用射线时，可直接照射细胞，在用致癌化学物或病毒时，需把这些物质加到培养物中，使之与细胞直接接触，但细胞受致癌物作用时间过长，或致癌物剂量过大，可导致细胞死亡。因此应用致癌物的剂量和作用时间要控制在能使细胞伤而不死，处于DNA合成阶段的细胞易受到致癌物损伤，因此让致癌物接触细胞的时间不宜少于6小时，但也不得超过48小时。在实验中常用的是致癌化学物，可分为直接致癌物与间接致癌物。直接致癌物如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍( N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ; MNNG）能直接损伤DNA诱发癌变；间接致癌物又称前致癌物，需经某些酶的活化，形成终末致癌物后，才能发生致癌的作用，终末致癌物具有强的亲电子性质，易与细胞核中含电子多的DNA,RNA和蛋白质等相结合，从而导致DNA的损伤，发生转化过程中的启动作用。

2. DNA的损伤与修复DNA损伤后可进行自我修复。修复是一复杂的过程，存在着不同修复机制和产生不同的结果。无误性的修复可使损伤DNA复原，但错误性修复能引起DNA的结构发生改变。当DNA损伤后如发生了错误性修复，而这种变化被固定下来即能引起不可逆的改变，标志着DNA发生了突变。从启动到损伤被固定下来，大约需24～48小时完成。

3．发展和表现细胞DNA受损和被固定后，通过细胞的反复增殖，使细胞损伤进一步得到发展和表现。受到一定剂量致癌物处理的细胞群，并非所有细胞都一定受到损害。受到诱发并进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分，这些细胞称为癌前细胞（precancerouscell)。它们生长在那些未受损的正常细胞之中，这两类细胞大约共同经过12～15个细胞周期的增殖以后，可能细胞已相互汇合融合成片。正常细胞不再分裂，但那些散在的前癌细胞却随着转化而不断发展，细胞汇合后不发生接触抑制，仍继续分裂增殖，并由于数量的增多而堆积起来，形成明显可见的转化灶。

（二）转化实验方法

【材料】

1．实验用细胞进行转化实验需选用合适的细胞，来源主要分以下两类

(1)原代细胞：原代培养的二倍体细胞易于制备，细胞发生转化后也容易识别，动物和人的原代培养细胞皆可应用。动物细胞以仓鼠胚胎成纤维细胞（embryonic fibroblast,EFs）较好，人原代细胞取自胚胎，小儿包皮和成人真皮等。

(2）传代细胞系：BALB/3T3,C3H10T1/2,BHK-21,NIH3T3,V79细胞株等均可。这些细胞的共同特点都已获得了无限生长的能力，变成了传代细胞系，也失去了二倍体核型，说明这些细胞都已发生了一定程度遗传变化，但却保持着正常细胞的接触抑制特征，而且接种同源动物体内无致癌性。

2．培养液与试剂

（1）完全培养液：85％高糖DMEM；15% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L谷氨酰胺。

(2）低血清培养液：95％高糖DMEM;5% FBS;O.1mM NEAA;2Mm/L谷氨酰胺。

(3）消化液：0.25% Trypsin-0.02% EDTA.

(4）冻存液：90% FBS;10% DMSO。

(5）Hanks液。

(6) MNNG水溶液。

【方法】

用原代细胞进行转化实验。多选用仓鼠13天的胚胎EFs。

1．取数个或所有同窝胚胎，去头和内脏，在无菌条件下剪碎至米粒大小，再用消化液37℃消化30分钟，吹打数次后过滤,1000r/min，离心5分钟。去除上清消化液，加Hanks洗1次，沉淀细胞加入培养液，制备5x10⁵/ml细胞悬液，接种入培养瓶中，37℃培养2～3天，能迅速长满瓶。

2．选生长状态良好的细胞，液氮冻存备用（传代过多不利于细胞转化）。

3．致癌物处理冻存细胞解冻后，接种于25 ml培养瓶中，每瓶含细胞（1～3)x10⁵。待细胞生长进入指增长期时，向培养瓶中加入致癌剂。致癌剂常用MNNG，剂量为1～3ug/ml营养液，在37℃孵箱中培养12～48小时。

4．弃掉MNNG作用液，用温PBS洗1～3次，加入培养液继续置孵箱培养2～3周（如用人细胞需1～3个月），然后更换培养液，用含5％血清培养液培养。低血清培养液不利于正常细胞生长，但已转化了的细胞仍可增殖，易形成转化灶。

5．转化灶的形成和分离用致癌物处理过的细胞于10天后，如果转化成功，在正常细胞之间可产生数量不等的转化灶。转化灶由密集的重叠细胞群组成；灶的大小不等，小者由几十或几百个细胞构成，大者肉眼可见。

6．转化现象出现后，为获得纯的转化细胞群，应把转化灶分离出来。转化灶分离可用两种方法：

(1)刮除法：先在有转化灶处瓶壁上用蜡笔圈出记号，再用胶皮刮刮掉未转化的正常细胞，向瓶内加入PBS冲洗掉刮除后，加0.25 % Trypsin少许置37℃孵箱中消化5～10分钟，待细胞松散后，弃掉消化液，加入新鲜的含10％～20％小牛血清培养液，以终止残余胰酶消化作用，用吸管反复吹打转化灶，使之脱离瓶壁成细胞悬液，再置37℃孵箱。

(2)消化法：先在瓶壁上用蜡笔圈出转化灶，弃掉瓶内培养液，选生长良好的转化灶，用不锈钢小环或无毒硅橡胶圈沾少许无菌明胶（不用亦可）套在转化灶上；向圈中滴0.25% Trypsin充分消化后，用弯头吸管把胰酶与细胞一同吸出接种入新培养瓶中，再补加营养液少许；置孵箱中继续培养。数日后转化细胞迅速增殖成新的细胞群。

【结果】

1．高倍镜下观察，转化细胞与正常细胞不同，如系成纤维细胞发生转化后，胞体变大成类多角形，生长无方向性，失去接触抑制，向三度空间伸延，细胞相互重叠。在转化灶的边缘转化细胞与正常细胞界限分明，形态区别非常明显。上皮细胞转化后，形态上不如成纤维细胞差别大，需仔细辨认。

2．无限细胞系用BALB/3T3或C3 H10T1/2细胞等，比原代细胞操作更简单，而且成功率高。转化程序与原代培养细胞相同。

【注意事项】

MNNG水溶液，有毒，用时注意防止污染环境；避光阴凉处保存，实验用液现配现用。用MNNG处理细胞不宜超过48小时。

（三）转化细胞的检测

用诱变剂或致癌剂诱发细胞转化，获得转化细胞群后，为确定转化细胞的性状，需进一步做一系列的实验分析。

1．细胞生物学一般性状包括细胞形态、生长速度、倍增时间等。

2．细胞遗传学特征核型分析，染色体组型畸变和标志染色体的有无。

3．恶性测试侵袭性试验，软琼脂培养，异体动物接种，凝集试验等。

以上测试中最重要的为第3项，说明发生转化的细胞是否为恶性转化。