肿瘤患者常因肿瘤病因和类型不同以及个体差异原因，对化疗药物的敏感性有很大差异。为了减少临床选择化疗药物的盲目性，实行个体化治疗，化疗前预测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性至为重要。肿瘤细胞对化疗药物敏感性的主要指标是细胞数量的增减。但是这一指标不能显示细胞的死亡和存活方面的信息。而用活细胞数量的增减来表达肿瘤细胞对化疗药物敏感性更为恰当。目前检测肿瘤细胞存活状况的主要方法为锥虫蓝排染法、四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltertrazolium bromide, MTT］法和放射性核素掺入法。锥虫蓝排染法由于其指标判断人为因素较多，较少应用。而MTT法能客观、准确地反映细胞的存活状态，故较常应用。

一、MTT法药物敏感试验

在正常情况下，细胞线粒体进行三羧酸循环过程中，琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢，并氧化成延胡索酸；而四氮唑盐可接受脱下来的氢离子，使可溶性的黄色四氮唑盐变成难溶性、紫蓝色的甲臜颗粒(formazan )，并沉积在细胞中，而死的细胞则无此功能。再用DMSO溶解紫蓝色的甲臜，在酶标仪下测定其吸光度A值，即可计算出存活细胞数。该方法具有快捷、方便、灵敏、经济的特点，并与临床治疗有较好的一致性。MTT快速比色法已被推荐为抗癌药物的筛选。

【材料】

1．瘤细胞来源临床瘤细胞的主要来源是外科手术的方法。将切下的瘤组织立即放入装有培养基的无菌冻存管中，4℃保存，12小时内使用。也可以是体外培养的细胞株。

2．药品与试剂待测定的化疗药物（表9-4。根据条件选择10种左右），MTT（用pH7.2～7.4的PBS现用现配成5mg/ml的MTT或配好后避光4℃储存备用一周），含10％小牛血清的RPMI 1640培养基（内含100IU/ml青霉素和100 ug/ml链霉素），DMSO,0.1％胶原蛋白酶,0.25% Trypsin-0.02％乙二胺四乙酸二钠盐（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) ,Hanks淋巴细胞分离液。

3．其他用具无菌的％孔板、手术剪,100目和200目不锈钢网、培养皿、离心管、加样枪及枪头、酶标仪等。

【方法】

1．无菌条件下剔除坏死及非肿瘤组织，用Hanks液冲洗一次。

2．用下述方法之一将肿瘤组织分散为单细胞：

(1)机械分散法：充分剪碎肿瘤组织，经100目和200目不锈钢网挤压过滤，收集细胞。

(2)酶消化分散法：充分剪碎肿瘤组织，首先经0.1％胶原蛋白酶37℃下消化20分钟，再用0.25 % Trypsin-0.02% EDTA (1：1混合液）37℃下消化，收集细胞。

3．将分散的细胞悬液，加入100％和75％浓度的淋巴细胞分离液梯度离心管中离心(2000r/min，离心20分钟），吸取最上层（75％分离液的界面上）的肿瘤细胞。

4．用Hanks盐平衡液离心洗涤2次，弃上清液，加入适量培养基重新悬浮细胞。

5．立即将肿瘤细胞悬液以10³～10⁴／孔接种于96孔板（200ul孔），同时加入事先确定浓度梯度的各组抗癌药10ul/孔（对照组加入培养基10ul/孔）。在37℃,5% CO₂孵箱中培养48～72小时（培养时间取决于实验的目的和要求）。

6．每孔加入MTT (5 mg/ml) 20 u1,37℃下作用4小时。

7．小心吸弃各孔内的上清液，对于悬浮生长的细胞需离心（1000r/min，离心5分钟），然后再吸弃上清液。每孔加入DMSO 150ul，振荡，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在波长450～600nm下测定吸光度A值。

8．各药物浓度组设3个平行孔，实验重复3次，取平均值计算药物作用后肿瘤细胞生长抑制率，公式如下：

细胞生长抑制率（％）＝（对照组吸光度A值-实验组吸光度A值）／对照组吸光度A值X100%

【结果分析】

若实验组的细胞生长抑制率>50%，即表明药物有效。

【注意事项】

1．接种细胞量要适宜。一般情况下，96孔培养板的一个孔内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后所占面积不同，因此需摸索几次，掌握细胞的生长速度，以保证培养终止时细胞不至于过满，这样才能保证MTT沉淀形成的量与细胞数量呈良好的线性关系。细胞过少也不行，容易造成各孔细胞接种不匀，引起较大的实验误差。

2．接种细胞时要不断吹打或轻摇，以使细胞尽量均匀地加入各孔中。

3．应在接种细胞的同时加入不同浓度的各种测试药物。

4．分离肿瘤细胞时要仔细，尽量勿混入正常组织细胞。