一、GM-CSF基因修饰的瘤苗制备

近年来，肿瘤的免疫治疗备受关注，其已成为继肿瘤手术治疗、放疗、化疗后第四种治疗方法。恶性肿瘤细胞只有在逃避正常的生长控制及宿主自身免疫识别的条件下才能最终形成肿瘤。肿瘤细胞逃避免疫监视的机制是由于机体免疫功能不全，而不是缺乏肿瘤特异性抗原。肿瘤患者机体免疫功能不全主要表现在：① MHC Ⅰ和Ⅱ类分子的低表达或不表达；②缺乏共刺激信号；③肿瘤抗原呈递细胞加工处理抗原能力不足；④T细胞诱导信号传递分子的丧失。针对上述不同类型的肿瘤细胞导入相应的基因，可提高肿瘤细胞的免疫原性，这就是肿瘤细胞的免疫基因修饰，涉及的基因包括细胞因子，MHC基因，B7,CD40L等共刺激信号分子等。目前研究最多的是细胞因子修饰的肿瘤细胞疫苗，本节先以GM-CSF分泌型肝癌疫苗为例介绍。

【材料】

1．实验动物及细胞株5周龄雄性SPF级ICR小白鼠，体重18～22g, GM-CSF分泌细胞，H22小鼠肝癌细胞株。

2．试剂10％灭活胎牛血清的RPMI 1640完全培养液、0.25%胰蛋白酶、原代肿瘤细胞处理试剂盒，TNF。

3．仪器流式细胞仪。

【方法】

1．细胞培养GM-CSF分泌细胞，H22小鼠肝癌细胞株均用含10％灭活胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，37℃,5% C0₂条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2. GM-CSF分泌型肝癌疫苗的制备按照原代肿瘤细胞处理操作说明将H22细胞株灭活处理后与GM-CSF分泌细胞按照5：2比例混合，制成“GM-CSF分泌细胞”，每支装量为0.3 ml，含有4x10⁶细胞，GM-CSF分泌量每24小时大于1ug/10⁶细胞；灭活的H22细胞称“H22肿瘤细胞”，每支装量为0.1 ml，至少含有1x10⁶细胞。

3．构建肝癌细胞移植瘤动物模型及实验分组将H22肿瘤细胞经小鼠腹腔传代7天后取出腹水，经PBS洗2遍，调整细胞浓度，以2x10⁶细胞／只接种于3组小鼠右前肢皮下，4天后，开始在右侧背部皮下进行免疫治疗。将上述肝癌细胞移植瘤动物随机分成3组（每组5只）①H22-GM-CSF组，接种GM-CSF分泌型H22肝癌疫苗，每只“H22肿瘤细胞”0.1 ml和“GM-CSF分泌细胞”30ul，融合后混合再注射；② H22组，接种H22肝癌细胞瘤苗，每只“H22肿瘤细胞”0.1ml;(3)PBS组，接种PBS，每只0.1 ml。

4．观察指标各组均每1周免疫1次，共3次，三次免疫后将小鼠处死，取出瘤组织，剔净结缔组织后放于托盘天平上称量瘤重，计算抑瘤率。第1周未实施免疫前各处死2只，3次免疫后1周，采用“眼球摘除法”获取荷瘤鼠外周血液，用流式细胞仪检测TNF。

计算抑瘤率＝（对照组平均瘤重一免疫组平均瘤重）／对照组平均瘤重）x100%。

【结果】

比较可发现H22-GM-CSF组抑瘤率比单纯H22组高，说明细胞因子GM-CSF修饰可提高肿瘤细胞的免疫原性。