对淋巴细胞群、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等功能测定可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能，为免疫性疾病的诊断提供依据，也有助于探讨某些疾病的发病机制、疗效判断、推断转归。近年来淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer,LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer, CIK）等体外制备的免疫活性细胞已成为肿瘤免疫治疗的核心力量。

一、人T细胞克隆的制备及功能测定

将单个T淋巴细胞从细胞群落中分离出来后单独培养的技术称为T淋巴细胞克隆技术，能使T细胞繁殖成为遗传背景一致且受体均一的单一克隆细胞群体。T细胞克隆的建立对于T细胞在免疫应答中的功能研究具有重要的意义。T细胞克隆技术以刺激细胞与效应细胞混合培养为基础，目前T淋巴细胞克隆的基本技术包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂克隆法等。本文介绍常用的有限稀释法（limiting dilution analysis, LDA)。

（一）淋巴细胞克隆的制备

T细胞的活化需要第二信号和细胞因子（例如IL-2)的作用。另外，T细胞克隆中采用有限稀释法将单个T细胞扩增为克隆，而单个细胞的生长和增殖需要饲养细胞，所以均使用经射线灭活的细胞作为饲养细胞，通常采用同种异体外周血单个核细胞（PBMC)作为饲养细胞，可显著提高T细胞克隆形成率。有丝分裂原可以刺激活化待克隆的淋巴细胞（反应细胞），通过有限稀释细胞到统计学的浓度，使培养板上每个微孔内含有1～0.3个反应细胞，在一定条件下培养，使单个反应前体细胞增殖繁衍成一个新的淋巴细胞集落，即单克隆T淋巴细胞，并予以数量扩增。

【材料】

1.96孔U形细胞培养板，24孔培养板，微量移液器，倒置显微镜，C0₂孵箱，离心机等。

2. RPMI 1640完全细胞培养液。

3. PHA-P,IL-2。

【方法】

1．淋巴细胞活化

(1)常规方法分离外周血单个核细胞（PBMC)。

(2)用完全细胞培养液将PBMC浓度调整为1x10⁶/ml，加入PHA-P，使其终浓度为1～2ng/ml。置5% C0₂,37℃孵箱培养。培养12～24小时后离心（1500r/min, 10分钟）弃上清液，用RPMI 1640洗3次（1500r/min,10分钟），再用完全培养液重悬细胞。

2．有限稀释法克隆T淋巴细胞

(1)用完全培养液对已经活化的细胞进行连续稀释，至每mi含10个、1个、0.3个反应细胞。

(2）取经40～60Gy照射处理的自体或同种异体PBMC用完全培养液悬浮成1x10⁶/ml，作饲养细胞用。

(3）将3个浓度的反应细胞和饲养细胞悬液各100ul加入％孔U形培养板，使反应细胞为10个／孔、1个／孔和0.3个／孔，而饲养细胞为（1～2)x10⁵／孔，添加PHA(1～2ul)、IL-2 (1～10ng/ml)，对抗原特异性T细胞克隆，加适量抗原（亦可不加），并留出一定量孔单加饲养细胞2x10⁵／孔作对照。每一个细胞浓度至少作48个平行孔。

(4) 5% C0₂,37℃孵箱培养2～3周，每4～6天换液，每孔吸出80ul陈旧培养液，加入100ul含IL-2 (1～10ng/ml）的完全培养液。

(5) 2周后在倒置显微镜下观察克隆生长情况，有细胞克隆增殖的孔，将该孔细胞作分孔培养，添加2x10⁵／孔去增殖活性的PBMC及1 ug/ml PHA和1 ng/ml IL-2，培养一周后，将增生良好的克隆转入24孔培养板，同时加入去增殖活性的PBMC 1x10⁶／孔和PHA(1～2ug/ml)，继续扩增，待细胞接近长满孔底后分孔继续培养。

(6)每隔10天左右用饲养细胞和PHA（及适量抗原）刺激克隆细胞，之间每隔4～5天以含IL-2 (1～10ng/ml )的完全培养液更换陈旧培养液，并根据细胞增生情况及时分孔，待扩增至一定数量时可转入培养瓶生长，细胞浓度维持于(3～5)x10⁵/ml。

【结果】

待细胞扩增至较大数量（10⁷～10⁸）时可冻存部分细胞，以备后用。

【注意事项】

1．克隆整个过程注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理。换液时动作应迅速而轻柔，以免吹散集落。

2．计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分率太低。

3．在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板。

4．因有限稀释后每孔细胞数呈随机分布，因而无法确证生长克隆所有细 胞均来自同一前体细胞。降低每孔接种数，或反复克隆可提高细胞单克隆的几率。

（二）克隆的功能测定

1．测定T细胞的辅助功能主要观测对自体B细胞的增殖和特异性抗体产生的辅助能力。常将放射去增殖活性的克隆T细胞与自体B细胞及特异性抗原和饲养细胞共同培养后，以³H-TdR掺入试验观察B细胞的增生情况，取培养上清液测定特异性抗体的产生量。

（1)辅助B细胞增殖试验

1)用E花环沉降分离法分离人T和B细胞。

2）将40 Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1x10⁴／孔与自体B细胞5x10⁴／孔以及40Gy照射的自体PBMC 5x10⁴／孔在适量目的抗原的存在下共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200 ul。

3) 5% C0₂,37℃培养7天，培养终止前24小时加入1 uCi³H-TdR/孔。

4)测定样本cpm值，比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞照射的影响程度。

（2）辅助特异性抗体产生试验

1)用E花环沉降分离法分离人T和B细胞。

2）将40Gy照射的抗原特异性T克隆细胞或无关T克隆细胞1x10⁴／孔与自体B细胞5x10⁴／孔以及40Gy照射的自体PBMC 5x10⁴／孔在适量目的抗原的存在下共同培养，每孔完全细胞培养液总量为200ul。

3）置5% C0₂,37℃孵箱培养3天，将细胞洗涤3次后以完全细胞培养液悬起后继续孵育7天。

4)收集培养上清液，测定上清液中特异性抗体含量。比较抗原特异性T克隆细胞和无关T克隆细胞对自体B细胞特异性抗体产生的影响程度。

2．测定T细胞细胞毒 T细胞克隆的杀伤能力多采用51Cr释放试验来衡量。根据克隆的抗原特异性和不同的试验目的，可选择携带特异性抗原的细胞或无关细胞作为靶细胞，后者常采用NK敏感的K562细胞或NK不敏感的H7402细胞。步骤如下：

(1)特异性靶细胞的制备：此类抗原多为胞内致病微生物如病毒、原虫及胞内感染菌等。将特异性抗原和无关抗原分别与自体或异体特异性抗原易感细胞共同孵育，时间在数小时～12小时不等。

(2）每1x10⁶/0.4m1靶细胞加100uCi51Cr,5% C0₂,37℃孵箱培养2小时。

(3）靶细胞洗3遍，按不同效靶比（如20:1,10:1,3:1等）与克隆细胞混合后37℃培养4小时（靶细胞为5x10³／孔，另设靶细胞对照孔）。

(4)吸取上清液测定cpm值，根据相应公式计算出细胞毒活性。

3．测定分泌细胞因子的功能可利用不同的诱导剂如相应抗原、抗CD3抗体、PHA等刺激克隆细胞，收集上清液后测定产生的各种细胞因子。一般步骤为：

(1)末次饲养细胞和PHA刺激后10～15天为理想的测定时间，此时饲养细胞基本死亡而克隆细胞也不再自发产生细胞因子。

(2)取克隆细胞，充分洗涤后以5x10⁴／孔加入96孔U形培养板，并添加40Gy照射的自体PBMC 1x10⁵／孔作为抗原呈递细胞，另设不加诱导剂孔作为对照。

(3) 5% C0₂,37℃孵箱培养，分别于24 ,48 ,72小时等不同时间收集上清液，无菌-20℃保存。

(4）用生物活性法或ELISA法测定各因子浓度。