巨噬细胞（macrophage）有多种功能，是重要的抗原递呈细胞，具有广泛的生物学效应。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞在条件适宜下可生活2～3周，多用做原代培养。可用各样方法来获取人巨噬细胞，以皮疱法最为实用。

（一）皮疱法获取人巨噬细胞

【材料】

斑蝥酊剂取药用斑蝥以95％乙醇制成10%酊剂，室温下浸泡两周后使用。

【方法】

1．取lcm²大小的滤纸片2张，蘸满斑蝥酊，置于一侧前臂皮肤上，在滤纸片上压一块稍大的塑料片，上面再敷以清洁纱布，固定。

2. 4～5小时后，取下塑料片和滤纸，可见局部皮肤发红，表皮开始松动，用一拱型塑料盖将局部罩好，固定包扎以防止开始形成的水疱破裂。

3. 48小时后，局部皮肤即形成一个完整的水疱。将皮肤消毒后，用无菌注射器小心抽取皮疱内渗出液，盛于无菌试管中。

4．局部用消毒纱布敷盖，2d后取下纱布。此法患者无疼痛及任何不良反应。斑蝥配诱发的皮肤炎性渗出液有多有少，大多在1～2ml，最多的可达8ml。

【结果】

皮疱液中含Mφ数平均为30％～40%，最多可达80%。

（二）巨噬细胞功能检测

1．吞噬功能的检测 巨噬细胞具有较强的吞噬功能，实验室常用比细菌大的细胞性抗原作为被吞噬颗粒，如鸡红细胞。

【材料】

(1)鸡红细胞（CRBC)悬液：取鸡血1～2ml，阿氏液抗凝（放4℃冰箱可保存2～4周）。试验前用无菌生理盐水洗3次，然后配成5% CRBC悬液。

(2) Giemsa染色液。

【方法】

(1）取皮疱渗出液0.5 ml加CRBC悬液0.Olm[1CRBC数为（5～6)x10⁶]；

(2)混匀，置37℃水浴中30分钟（每隔10分钟轻轻摇动一次）。1000r/min离心5分钟，弃上清液，留少许液体将细胞充分混匀，涂片，甲醇固定，Giemsa染色（或G-W混合染色）。

【结果】

油镜下观察并计数100～200个M(D；吞噬细胞％：即100个M(D中吞噬有CRBC的细胞数。吞噬指数：将100个Mφ所吞噬CRBC的总和除以100，所得每个Mφ吞噬CRBC的平均数，即吞噬指数。

【注意事项】

在计数时应同时注意CRBC被消化的程度，共分4级：

Ⅰ级：未消化一胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫红色。

Ⅱ级：轻度消化一胞质浅黄绿色：核固缩，染成紫蓝色。

Ⅲ级：重度消化一胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。

Ⅳ级：完全消化一Mφ内只见形状似CRBC大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。

2．巨噬细胞表面受体的检测 成熟的巨噬细胞表面具有Fc受体和C3b受体，这些受体能识别经IgG和C3b调理的颗粒，并迅速与之结合，促使细胞对相应颗粒的吞噬，为此检测这些受体可间接判断巨噬细胞的功能。常用抗羊红细胞致敏的羊红细胞悬液作指示物进行EA花环试验。

【材料】

（1)兔抗羊红细胞抗体IgG，其凝集试验效价应大于1：160;

(2）巴比妥缓冲液（BBS)，pH 7.4～7.8;

(3) 2％戊二醛缓冲液和Giemsa染液；

(4)绵羊红细胞（SRBC）悬液：抽取羊血经脱纤维处理，以1:3比例保存于无菌的Alsever液中，置4℃冰箱可保存1个月。临用前，将SRBC用BBS洗3次，第3次2000r/min离心5分钟，弃上清液，再用BBS配成10%（V/V) SRBC悬液。

【方法】

(1) Mφ的制备：将0.5ml的Mφ悬液（如皮泡液）滴于干净的载玻片上，于37℃湿盒中放置2小时。然后用PBS冲洗，除去非黏附细胞，则残留的单层细胞大多数为Mφ(>90%）。须防止玻片干燥而致细胞死亡。

(2) EA悬液载制备：将兔抗SRBC抗体IgG用PBS作亚凝集水平稀释（稀释倍数略低于抗体凝集效价）。取稀释后的IgG液1份与等体积10% SRBC悬液于试管内充分混匀，置37℃水浴中30分钟，中间摇动1次，取出后用PBS洗2次，以除去游离的IgG。最后，配成5%（V/V）致敏SRBC悬液（EA)。

(3)在单层Mφ玻片上，加0.2m1 EA悬液，平置4℃冰箱2小时。

(4）取出玻片，用PBS轻洗，去除多余的SRBC，用2％戊二醛固定，Giemsa染色。

【结果】

在显微镜下观察EA花环形成，并计数。一般黏附5个或5个以上SRBC的Mφ作为一个花环，随机观察200个Mφ，计算花环形成细胞的百分率。

3. Mφ酸性磷酸酶测定 巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶、非特异性酷酶、溶菌酶等，测定这些酶的活性也是衡量巨噬细胞功能的实用指标之一。在适当的酸性条件下，Mφ内的酸性磷酸酶能水解底物β-甘油磷酸钠形成磷酸盐，后者与硝酸铅反应产生磷酸铅。磷酸铅再与硫化铵反应最后形成黑色硫化铅，沉积在酸性磷酸酶所在处，显示棕黑色颗粒。

【材料】

(1)底物反应液：将3%β-甘油磷酸钠50ml,0.05mol/L醋酸缓冲液500m1，硝酸铅0.6g混合即成。临用前置37℃温箱预温至37℃后使用。

(2) 2％戊二醛；

(3) 1％硫化铵；

(4) 30%,50%,70%,80%,95%,100％乙醇；

(5）二甲苯。

【方法】

（1）取新鲜皮泡液0.5～1.Oml,1000r/min离心10分钟；

(2)取沉淀细胞涂片，用吹风机迅速吹干；

(3)涂片加冰冷的2％戊二醛固定30分钟，用蒸馏水洗3次后，用0.05mol/L的醋酸盐缓冲液洗1次；

(4）将涂片放入底物反应液中，37℃温育30～90分钟；

(5）涂片用蒸馏水洗3次后，用1％硫化铵处理1分钟，以流水冲洗1分钟；

(6）依次用30%,50%,70%,80%,95% ,100％乙醇脱水各5分钟；

(7）最后用二甲苯固定，透明树胶封片。

【结果】

Mφ胞质内酸性磷酸酶所在处呈棕黑色颗粒。酶活性的强弱可根据颗粒的数量和粗细的不同而分级判断。颗粒数量少且细者为“+”，颗粒多而粗者为“3+”，介于两者之间为“2+”。

【注意事项】

(1)酸性磷酸酶主要位于Mφ胞质的溶酶体内。未经固定的溶酶体脆弱，温育时容易发生破裂，故须固定后再进行反应，效果较好，定位清晰；

(2）酸性磷酸酶不稳定，活性易丧失，所以固定液应冷冻，固定时间宜短；

(3）在定位反应液内的反应时间，因实验条件和材料不同而异，需通过预试验找出最适宜的反应时间。

4．巨噬细胞促凝血活性测定激活巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl₂混合液，加入经黏附单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。实验证明当巨噬细胞与LPS、肿瘤相关抗原或乙型肝炎病毒的HbsAg等温育后，可见血浆凝固时间明显缩短。本法稳定方便，也是检测不同疾病患者巨噬细胞功能的指标之一。