淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer,LAK）和肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL )在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，其制备及活性测定对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。以下主要介绍LAK/TIL细胞的常规制备方法。

（一）LAK细胞的制备

【材料】

1. rhIL-2；

2．新生牛血清（NCS)；

3. RPMI 1640细胞培养液；

4. PHA 。

【方法】

1．外周血单个核细胞（PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导

(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20％人血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至1x10⁶～2x10⁶/ml悬液。

(2）同时加入60 ug PHA及rhIL-2（终浓度500U/ml)。

(3)接种到适当容量的培养瓶中，置37℃,5% C0₂培养箱中培养。

(4）培养2～3天。换液，吸弃1/2上清液，加入含500U/ml的重组人rhIL-2及20%NCS的RPMI 1640培养液，继续培养3天，收集细胞，即为LAK细胞。用无菌生理盐水将细胞洗涤1次，并配成适当的细胞悬液，供研究或临床治疗用。

2．脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导正常人外伤摘除的脾脏通过灌注去除红细胞后，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20％人血清的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至1x10⁶/ml，同时加入60 ug PHA及rhIL-2（终浓度500 U/ml )，接种到适当容量的培养瓶中，将细胞置37℃,5% C0₂条件下培养，2～3天换液一次。培养6～7天收集细胞，即为LAK细胞。

（二）TEL细胞的制备

【材料】

1. rhIL-2；

2．新生牛血清（NCS)；

3. RPMI 1640；

4. I ,Ⅳ型胶原酶；

5. 0.001％的透明质酸酶和DNA酶。

【方法】

1．无菌切取肿瘤组织或肿瘤浸润的局部淋巴结，置于含抗生素的RPMI 1640培养液中。

2．将肿瘤组织机械剪碎，用RPMI 1640调整体积为10～20ml，同时加入0.05％的I、IV型胶原酶,0.001％的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4～6小时。

3．分别用80目和200目不锈钢网过滤。

4．过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI 1640洗2次，1500r/min离心5～10分钟。

5．用含5 % NCS的RPMI 1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100％淋巴细胞分层液加入试管底层，其上缓慢加入75％的淋巴细胞分层液（用RPMI 1640配制）然后缓慢加入上述肿瘤细胞悬液3～5ml。

6. 1500～1800r/min离心20分钟后，分别收集75％和100％淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。

7．收集的TIL细胞用RPMI 1640洗涤2次，每次1500r/min离心5～10分钟。肿瘤细胞液氮冻存，TIL则用含20% NCS的RPMI 1640调整细胞浓度为0.5x10⁶/ml。

8．将上述细胞悬液接种于24孔培养板（1 ml/孔），同时分别加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb l ug/ml，置37℃,5% C0₂孵箱培养3～4周，其间3～5天更换新鲜配制的含IL-2的RPMI 1640完全培养液。

（三）LAK细胞和TIL细胞活性的测定

LAK细胞和TIL活性的测定常采用核素法如51Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT比色法等。在此介绍MTT比色法。

【材料】

1．试剂与细胞培养板

(1)四甲基偶氮唑盐（MTT) ;

(2）含0.04mo1/L HC1的酸化异丙醇；

(3) 96孔细胞培养板。

2．肿瘤细胞系 Raji细胞、Daudi细胞（B细胞性白血病细胞株）；Molt-4细胞（T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感）；K562细胞（红白血病细胞，对NK细胞毒作用敏感）。所有细胞株均培养在含10％～20% NCS的RPMI 1640完全培养液中，取对数生长期细胞用不完全培养液洗涤，锥虫蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至2x106/ml备用。

【方法】

1．用含IL-2的20% NCS-RPMI 1640培养液调整LAK或TIL细胞浓度至1.5x10⁶/ml。

2. LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1:1～1:20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。不同浓度效应细胞每孔接种200微升／孔单独培养，以测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20%NCS-RPMI 1640培养液调整至3x10⁴～1x10⁵/ml，取l00ul细胞悬液和l00ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。

3．将上述接种好的细胞培养板置37℃,5% C0₂温箱孵育20小时。

4．于终止培养前，每孔加入MTT 10ul，混匀后再培养4～6小时。

5．吸弃上清液，每孔加0.l ml酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。

【结果】

于酶联仪上测定吸光度（OD)，检测波长570nm。

细胞毒性百分率按下列公式计算：

ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值

ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值

ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值