肥大细胞（mast cell)分布在呼吸道、消化道黏膜及皮肤、浆膜、血管、淋巴管、末梢神经周围的结缔组织中。在过敏原的作用下，肥大细胞释放胞质颗粒内活性介质，如肝素、组胺、5-羟色胺等，引发I型超敏反应。

（一）组织肥大细胞的分离

以肠道标本为例，首先机械破碎，然后通过酶消化后获得肥大细胞。

【材料】

1．手术切除的肠片段3～5g;

2．含5％新生牛血清的Hanks;

3．胶原酶A液含20% NCS和1ug/ml胶原酶的Hanks;

4．胶原酶B液含20% NCS和0.5ug/ml胶原酶的Hanks;

5. Hanks/ETDA液含0.13mmol EDTA的Hanks;

6. N-乙酰基-L-半胱氨酸洗液：用HBSS配成50mmol/L浓度。

【方法】

1．用剪刀将肠片段剪成小块，生理盐水轻轻晃动洗涤。

2．将剪碎的组织块放入装有以下预温的液体内，37℃下轻轻晃动，洗涤；先放Hanks/ETDA液内洗涤2次，每次5分钟，再放N-乙酰基-L-半胱氨酸洗液洗涤1分钟，然后用Hanks液洗2次，每次10分钟。

3．弃掉洗涤液，用剪刀将组织块剪成1 mm³的碎块，分别置于几个培养皿内。

4．每个培养皿中加入胶原酶A液25 ml , 37℃条件下，轻轻搅动孵育90分钟。

5．将每个培养皿中的液体移入50m1离心管，4℃,1000r/min离心10分钟，弃上清液；加入Hanks液，冰浴保存。

6．在每个培养皿剩余的组织碎片内加入胶原酶B液25 ml ,孵育60分钟，然后用吸管反复吹打，使组织分散成单个细胞，铜网过滤，获得肥大细胞。

7．将上述两个步骤获得的肥大细胞合并，4℃ ,1000r/min离心10分钟，弃上清液。

8．加5m1 Hanks液后，用5ml聚酰胺纤维柱滤去碎片及细胞团块，再加5m1 Hanks液洗涤该柱，收获的细胞悬液于4℃下，1000r/min离心10分钟，弃上清液，用Hanks重悬，冰浴保存。

（二）过敏原引起的体外肥大细胞脱颗粒检测

在过敏原或药物的作用下，肥大细胞发生脱颗粒( degranulation )，可采用甲苯胺蓝染色法直接镜检观察。

【材料】

1. pH 7.4的Tyrode液；

2．阳性对照品：C48/80;

3．过敏原或药物；

4. 0.5％甲苯胺蓝染液；

5．甲醇固定液。

【方法】

1. 5x10⁵/ml浓度的肥大细胞悬液设置三个实验组：阳性对照组（C48/80组）；阴性对照组（Tyrode液组）以及药物作用组，每组3个复管，每管200 uL细胞悬液。

2．阳性对照组加入50 uL C48/80，阴性对照组加入50uL Tyrode液，药物作用组加入50 uL药物或过敏原，37℃水浴45分钟。

3．取作用后的细胞悬液每管5 uL做细胞涂片，快速干燥，甲醇固定20分钟，0.5％甲苯胺蓝染色20分钟，计数1000个肥大细胞，计算脱颗粒率。

【结果】

显微镜下可见正常肥大细胞体积比淋巴细胞大，圆形或椭圆形，细胞轮廓清晰，胞膜光滑完整，被甲苯胺蓝染成深蓝色，胞质内有紫红色异染颗粒（图10-2)；发生脱颗粒的肥大细

胞形态多样，胞膜凹凸不平，颗粒外溢，细胞周围有散在的颗粒痕迹，颗粒完全脱出时细胞呈空泡状（图10-3)。肥大细胞的脱颗粒率按以下公式计算：

脱颗粒率（％）=脱颗粒细胞数/肥大细胞总数x100%。

【注意事项】

1．结果观察应在15分钟内完成，以免发生自发性脱颗粒。

2．过敏原种类很多，选择抗原要恰当；过敏原的加入量与检测结果有关，应做预试验选出最适含量，以防出现错误结果。

3．肥大细胞仅可保存4小时左右，超过4小时则失去活性。

（三）病变组织肥大细胞脱颗粒观察

以皮损组织为例，可制成切片直接以甲苯胺蓝染色观察。

【材料】

1．皮损组织；

2. 10％甲醛液；

3. 0.5％甲苯胺蓝染液；

4．丙酮；

5．二甲苯及中性树胶。

【方法】

1．组织块用10％甲醛液固定，按常规脱水透明，石蜡包埋，切片厚10um。

2．切片脱蜡至水，入甲苯胺蓝液染色5小时（常温）。

3．脱水：纯丙酮I，Ⅱ各10分钟。

4．透明：二甲苯I，Ⅱ各10分钟，中性树胶封片镜检。