Mo7e细胞系对GM-CSF具有高度生长依赖，且呈剂量依赖关系。Mo7e对IL-1,IL-4,IL-5,IL-6,TNF刺激不敏感。可采用³H-TdR掺入法进行活性检测。

【材料】

1．细胞株源于人急性原巨核细胞白血病的Mo7e细胞系。

2. Mo7e维持培养液为DMEM，含10% FCS,10ng/ml rGM-CFS和0.5 ng/ml IL-3。

【方法】

测试时培养液不含任何生长因子。Mo7e细胞先在DMEM-FCS培养液中培养3天，用DMEM洗涤二次后，再悬于DMEM-FCS中，浓度为2x10⁵/ml。于96孔微量培养板每孔加入2x10⁴个Mo7e细胞和经倍比稀释的样品或标准品GM-CSF，另每个样品孔加抗IL-3单抗。标准品孔加等体积的培养液。各个稀释度设3个复孔。对照加Mo7e细胞和培养液。37℃，5% C0₂孵育72小时，然后每孔加入18.5kBq ³H-TdR，再孵育4小时。多头细胞收集器收集细胞于滤纸上，烤干后进行液闪计数。

【结果】

参照标准GM-CSF量效曲线，便可得出样本GM-CSF活性。

【注意事项】

试验中应加入抗IL-3抗体排除干扰。

以上细胞因子检测方法都是从蛋白水平对细胞因子进行测定，而分子生物学方法则是从基因水平，检测其mRNA的表达情况，近年来，分子生物学的检测技术发展迅速，由于几乎所有公认的细胞因子的基因均已被克隆化，因此可利用基因探针检测这些细胞因子mRNA的表达，其方法多种多样，如斑点杂交、Northern转印、细胞／组织原位杂交和RT-PCR等。尤其是定量PCR的出现使细胞因子mRNA的定量分析成为可能。

细胞培养用于IFN的活性检测

【原理】

α与β型干扰素均具有抗病毒活性，当未加IFN的对照孔75％～100％细胞出现病变，而未加病毒的细胞对照依然完好时，此时若与某一稀释度的IFN标本共育的细胞仍有50%左右不出现病变，则表示该样品内含有保护细胞的足量IFN，其稀释度即为标本中含有的IFN效价。但由于各实验室所用细胞和病毒种类不同，测定条件各异，所得活性单位（u)会有很大不同。故必须经国际参考品校正后得出统一的单位，即用国际单位（IU）表示。

【材料】

1．细胞 测人IFN用A549细胞或Hep-2细胞，测鼠IFN时用L929细胞。细胞浓度4x10⁵/ml。

2．病毒 水疱口炎病毒（VSV) 5x107 pfu/ml。

3．培养基 MEM-Eagle培养液+10％小牛血清、青霉素10u/ml与链霉素10O ug/ml。

4．染色液 0.2％结晶紫（结晶紫2g、甲醛50ml,95％乙醇500ml, NaCL8g加蒸馏水至1L，用滤纸过滤）。脱色液：乙二醇单甲醚加等量蒸馏水配制。

5. IFN标准品、标定为50001U/ml。

6.96孔微量培养板、微量移液器（40～200ul）、微量振荡器、倒置显微镜、酶标比色仪、胶带等。

【方法】

1．于96孔培养板上加培养基100微升／孔，在A,B两排第1孔内加1:10 IFN标准品稀释液100ul，在C,D两排第1孔内加待测样品各100ul，用移液器将各排作倍比稀释，即于第1孔内反复吹吸5次混匀，吸出100ul加到第2孔内混匀，并依次向下移入100ul作倍比稀释至第9孔，最后吸弃100ul。每排作稀释时均换一个移液吸头。A,B两排第10孔作病毒对照，C,D两排第10孔作细胞对照。

2．倍比稀释后，向各孔内加入100ul细胞悬液（4x10⁵/ml)，加盖静置10～20分钟，待细胞自然均匀沉降后置37℃,5% CO₂孵箱中培养。

3．培养6小时后用倒置显微镜观察，若成单层细胞即可攻毒，向各孔加入一定浓度的VSV100ul（使用浓度以24小时出现CPE为适度。若检测，γ-IFN时需24小时后再攻毒）。细胞对照孔加培养液100ul。18～24小时后待病毒对照孔细胞几乎达100% CPE时，可倾去培养液，各孔加染色液染色40小时，染毕用水洗板，空气晾干。此时一般用肉眼即可估计出效价。

4．直接用酶标比色仪进行检测。（一般不需脱色，但当细胞分布不均一时，可于比色前先加200ul脱色液，脱色20分钟）比色波长用550nm，最后根据光密度（OD）值计算出样品中IFN的活性单位。计算方法是先算出50％细胞病变时的OD值，即（细胞对照孔OD550+病毒对照孔OD550)÷2，再将样品在两对照值之间的各OD550及其稀释度的对数分别输入计算器，并按指数回归方程（y=a·ebx）按键，求出相当于50％病变OD值的稀释度，即样品的IFN活性单位，最后用标准IFN值加以校正成国际单位（IU)。