【材料】

1．免疫磁珠、荧光染液；

2．倒置荧光显微镜；

3．其他（同上）。

【方法】

1．免疫磁珠法分离T/B淋巴细胞的操作步骤：取2ml ACD抗凝血、加20ul磁珠→旋转3分钟，加2ml Developer混匀、置磁架孔中3分钟（带有磁珠的T/B淋巴细胞被吸附在有磁性的一侧）→去除液体→用PBS清洗2次→获得纯化的T/B淋巴细胞。

2．采用免疫磁珠3～5 ml分离出淋巴细胞，在Terasaki板上每孔加入无菌矿物油5 ml，每排第1孔加生理盐水1 ml做阴性对照，第2孔加抗全淋巴细胞抗体1 ml做阳性对照，第3～6孔各加受者血清1 ml（即重复4孔试验），每孔各加供者淋巴细胞1 ml细胞浓度为2000/ml)，每孔各加补体I ml，置22～25℃室温下反应45分钟左右，每孔加荧光染液5ml，在倒置荧光显微镜下观察细胞毒性反应，分析判断结果

【结果】

倒置荧光显微镜下死细胞呈红色，活细胞呈绿色，对比分明，易于识别。

莱姆德细胞板方法（CDC-LCT方法）

【材料】

l. McCoy'3或RPMI 1640（含5％加热灭活胎牛血清）；

2．矿物油；

3．补体；

4．甲醛等。

【方法】

1．将McCoy's或RPMI 1640（含5％加热灭活胎牛血清）试剂置于37℃孵育箱，同时在37℃孵育箱中溶化LCT细胞板5分钟。

2．每孔加20ml上述McCoy's或RPMI 1640液。

4．适度用力甩掉液体。

5．每孔加5 ml矿物油。

6．除阳性与阴性对照孔外，每孔加1 ml血清。

7．室温孵育（20～25℃)30分钟。

8．每孔加5 ml补体。

9．室温孵育（20～25℃)30分钟。

10．终止反应 10m1 Stain(一步法）、或5ml伊红，1分钟后加5ml甲醛溶液；也可加入5 ml荧光终止剂（荧光法）。

【结果】

根据死亡淋巴细胞的比例综合评分，死亡细胞＞40%（评分为4分以上）为阳性。再根据死亡孔所占比例，计算群体反应性抗体（population reactive antibody, PRA）阳性率。

也可应用LCT分析软件，将阳性反应键入相应的孔内，计算机将自动报告抗体的特异性。注意：抗体的特异性远远重要于群体反应性抗体（PRA）百分率。

【注意事项】

1．阳性对照孔和阴性对照孔为补体质量控制，不应加血清。

2．血清收集与处理取5 ml静脉血，根据有无抗凝剂及不同抗凝剂制备血清。

3．无抗凝剂去掉血块，3000r/min，离心10分钟。

4．肝素钠抗凝剂3000r/min，离心10分钟。将血浆转至相应管中。每ml血浆加1滴凝血酶（每6ml无菌水含10000单位）。充分混匀后，去掉纤维凝块。再次以3000r/min离心10分钟，将血清转至另一试管。

5. EDTA或枸橼酸抗凝以3000r/min离心10分钟。将血浆转置相应管中。每ml血浆加1滴氯化钙（1％溶液）。充分混匀后，加1滴凝血酶（每6m1无菌水含10 000单位）。混匀后，去掉纤维凝块。再次以3000r/min离心10分钟。将血清转置另一试管。

6．对于血液透析的患者，应在透析前采取标本。

7．血清可在常温下运输（48小时内）。

8．血清应储存在-70℃以下的冰箱中。-30℃冰箱可储存数日。根据应用情况适当分装。每次冻融不得超过1次。

9. pH可影响抗体活性。干冰的蒸发可释放二氧化碳，降低pH。应避免长时期暴露于干冰中。

10．细菌污染可影响抗体活性。标本中可加入少量0.1％的叠氮钠（sodium azide )。

11．标本溶血可视为标本处理不当或过于陈旧。

12．根据监测结果可稀释血清。如阳性反应在稀释1倍后消失，说明致敏不明显，反之，稀释1:8后仍呈阳性，表明高度致敏。

13.稀释液为普通缓冲液或组织培养液，但需含有经60℃,30分钟灭活的5％～10%胎牛血清。

免疫磁珠流式细胞仪方法（flow PRATM beads方法）

【原理】

采用单克隆抗体从EB病毒转染的细胞株中纯化HLA抗原，包括所有常见的和稀有的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原。抗原分别包被在数十个微颗粒免疫磁珠上（30个I类磁珠和30个Ⅱ类磁珠）。当加入待检血清于室温（20～25℃)孵育时，包被不同的HLA抗原的磁珠即与相应的抗体结合，再加入荧光交联的Fab段的羊抗人IgG二抗孵育，终止、固定，通过流式细胞仪检测和分析血清标本中HLA抗体的强度和特异性。

【材料】

1. HLA抗原纯化与免疫微磁珠包被美国莱姆德公司已有商品化试剂提供，包括I类磁珠30个和Ⅱ类磁珠30个。

2．采用Ⅰ类磁珠和Ⅱ类磁珠筛选HLA抗体。

【方法】

l. 5 ml Ⅰ类磁珠或Ⅱ类磁珠与20ml待检血清混合。

2．室温下（20～25℃）孵育30分钟，轻轻振荡。

3. Flow PRA洗液，洗3次（每次以20 OOOr/min离心2分钟）。

4．加入100ml FITC交联的羊抗人IgG，室温(20～25℃）孵育30分钟。

5. Flow PRA洗液洗2次。

6．加入0.5 ml固定液。

7．流式细胞仪检测，分析5000个FLl荧光。

8．如果是采用Ⅰ类和Ⅱ类抗体混合磁珠筛选HLA抗体，则在第一步时各用5 ml Ⅰ类磁珠和5u Ⅱ类磁珠与20ml待检血清混合，其余步骤相同。

【结果】

分析免疫磁珠流式细胞仪方法的测定结果。