具高度多态性的HLA糖蛋白大多表达在有核细胞的表面。应用微量淋巴细胞毒技术，将外周血单个核细胞（PBMC)与抗HLA特异性抗体（同种抗血清或单克隆抗体）及兔补体混合培养，计数死亡细胞比例来判断结果。

【材料】

1．专用单联、六联加样器：1ml,5ml两种；

2．无菌水；

3．矿物油；

4．固定液：伊红与甲醛，或一步法终止液Stain Fix;

5．应用荧光法：荧光终止液（FQAE）代替伊红与甲醛；

6．配型板覆盖玻璃片或Terasaki密封板；

7．相差倒置显微镜（应用荧光法：荧光相差倒置显微镜）；

8．专用单克隆抗体分型板（一般用亚洲型ASN)。

【方法】

1.淋巴细胞分离方法有

（1）细胞分离剂（T-Kwik或B-Kwik )

(2）Ficoll-Hypaque法；

(3）磁珠分离法（Fluor-Beads)。

2．基本操作步骤

（1) HLA单克隆抗体冷冻板分型技术

1)融化：将配型板放置室温15分钟（补体已加于冷冻板内）；

2）加细胞：每孔加l ml淋巴细胞。细胞含量为每1 ml 200万个左右；

3）混匀：用静电混匀器或细小的金属丝；

4)孵育：室温（20～25℃）下孵育1分钟；

5）终止反应：①荧光法加5 ml FQAE；②普通染色法加5 ml Stain Fix或5m1伊红，2分钟后加5 ml甲醛；

6）密封：用Terasaki密封板或玻璃片密封试剂板；

7)读板及描述反应：终止反应后15分钟可读板。根据细胞死亡数的百分比判断抗原抗体反应（NIH计分法，表10-4）。

(2) HLA-I类、II类单克隆抗体分型技术

1)溶解补体：①加1 ml冷无菌水（2～5℃）于干燥补体管内；②轻轻摇晃补体管，促进溶解；③使用前温度保持在2～5℃（放置含有冰块的器皿中）；④立即分装剩余补体并储存于-20℃或以下冰箱中；⑤补体冻融不得超过1次。

2）操作步骤：①每孔加1 ml无菌水溶解抗体，溶解后，保持在2～5℃（不要超过2小时）；②每孔加5m1矿物油；③每孔加l ml T淋巴细胞（I类）或B淋巴细胞（II类），细胞含量为2x10⁶/ml;④每孔加1 ml补体并混匀；⑤37℃水浴孵育1小时；⑥每孔加5ml伊红，2分钟后加5 ml甲醛（最好用Stalntm一步法Stain Fix) ;⑦用Terasaki密封板或玻璃片密封试剂板；⑧应用荧光法者，第6步改为：每孔加5ml FQAE。

(3) HLA-B27单克隆抗体板分型技术

1)溶解补体：用冷无菌水溶解补体（2～5 ℃）。应用前放在有冰的器皿上；

2）溶解抗体：加1 ml无菌水于B27板含有抗体的孔中；

3）加细胞：每孔加1 ml细胞。细胞含量为2x10⁶/ml左右；

4)加补体：每孔加1 ml溶解的补体并混匀；

5）加矿物油：每孔加5 ml矿物油（防止挥发）；

6）置7℃孵育1小时；

7）加染色液：每孔加5ml Stain（染色液）；

8)结果：相差倒置显微镜下判断细胞存活状况。

【结果】

根据细胞死亡的百分比判断抗原抗体反应。伊红染色，在相差倒置显微镜下可见活细胞呈明亮，死细胞呈深暗色。应用荧光法，在荧光相差倒置显微镜下活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色。目前，国际上通用NIH方法计分，详见表10-4。
每块配型板均附有一份反应记录表（code sheet)，将阳性反应结果读数填到相应孔空格内。每一批号的配型板都附有反应格局判断表，以帮助指定相应的抗原。

【注意事项】

1．常见问题与解决方法

(1)本底过高，死细胞过多，出现假阳性。常见干细胞分离和所用试剂不当。其解决办法为：①改善细胞分离方法。最好用免疫磁珠法，普通倒置显微镜可观察T磁珠分离的T细

胞，但B磁珠分离B细胞需荧光显微镜；②分离出的淋巴细胞应溶于5％的McCoy's液中。

(2）细胞量过少或过多。其解决方法是在加细胞前先检测细胞含量。

(3)每孔细胞不均匀。其解决方法是用软加法，即先将加样器吸一点空气，再吸取细胞或试剂。

(4)反应弱。其解决办法为：①避免应用RPMI可抑制抗原表达）；②检测试剂PH（偏高可抑制反应）；③加样后用静电混合器或金属丝混匀；④延长孵育时间。

2．单克隆抗体冷冻板注意事项

(1)保证冷冻板的储存环境，对于立式-80℃冰箱，应存放在最底层；

(2)融化的板不应再次冷冻，融化后尽快应用，不要超过1小时；

(3）操作过程中避免加样器接触板底，防止造成交叉污染；

(4)避免个别孔漏加细胞。

3．单克隆抗体HLA-B27分型注意事项

(1)补体在应用前，始终保持在冷环境中（放置在有冰的器皿上）。补体对温度比较敏感；

(2)剩余补体立即冷冻储存，补体冻融不超过1次；有条件的单位，补体宜一次性使用；

(3)每块板含3人或6人份，不同标本加样时避免交叉污染；

(4）一次未能用完的板，可将剩余的抗体溶解后加5微升矿物油低温储存。冻融不超过1次；

4. HLA-Ⅰ、Ⅱ类单克隆抗体分型，常见的问题与解决方法如下。

(1)本底过高，即死细胞过多，出现假阳性。常见于分离细胞和所用试剂不当。其解决方法是改善细胞分离方法，可用40％的Percoll液去掉死细胞，分离出的T细胞应溶于5％的Mecoy’s中；

(2）细胞量过少或过多，其解决方法是在加细胞前先检测细胞浓度；

(3)每孔细胞不均匀。其解决方法是用软加法，即先将加样器吸一点空气，然后再吸取细胞或试剂。

(4)反应弱。其解决方法为：①避免补体反复冻融，防止个别孔补体漏加；②避免应用RPMI 1640培养液〔可抑制抗原表达）；③应检测试剂PH（偏高可抑制反应）；④加样用用静电混合器或金属丝混匀；⑤检测HLA-II类时，如T细胞或单核细胞污染，需改进细胞分高方法；⑥将分离出的B细胞先在37℃孵育30分钟，然后再点板。

(5）应注意以下事项：①干板与干燥补体需储存在2～5℃或以下冰箱中；②如果每袋干板一次不能用完，剩余板应密封或储存于-20℃以下的冰箱中（避免湿气溶解抗体）；③操作过程中避免加样器接触板底；④避免个别孔漏加细胞或试剂。