动脉粥样硬化的发生和发展受许多因素的影响，最后导致血管壁形成大小不一的斑块，妨碍相应组织器官的血液供应。泡沫细胞（foam cell)的出现是斑块病变早期的细胞学特征，它是由单核一巨噬细胞或增殖移行的动脉中膜平滑肌细胞（SMC)摄取大量的脂质而成，利用巨噬细胞或SMC制作泡沫细胞模型，可作为实验研究抗AS药的方法之一。

巨噬细胞和移植的SMC表面有清道夫受体（scavenger receptor)，能无限制地摄取大量修饰变性的低密度脂蛋白（LDL)，特别是_0XLDL，使细胞内在量脂质充盈，在电镜或光镜下呈泡沫状，故称泡沫细胞。经油红0染色后呈红色颗粒状，含大量胆固醇（cholesterol, Ch)，胆固醇酯(cholesterol ester, CE）约占其50%。故先制备_0XLDL，再使其作用于巨噬细胞或SMC细胞，可形成泡沫细胞。

【材料】

1．动物 C₅₇BL/6J雄性小鼠。

2．试剂 无血清培养基RPMI 1640、胎牛血清，D-Hanks液、胰酶、EDTA,NaN₃,PBS,CuS0₄、硫代巴比妥酸、丙二醛、总胆固醇试剂盒（TC)、游离胆固醇试剂盒（FC)、甲醛、油红0、异丙醇。

3．器材 超速离心机、电泳仪、透析装置、培养瓶、CO₂培养箱、倒置显微镜、照相机、彩色胶片、超声波清洗器、新鲜全血。

【方法】

1. LDL的制备和鉴定取新鲜全血200 ml，不加抗凝剂分离出血清 120ml，加入NaN₃ 24mg, EDTA (100mg/L) 0.6ml以防腐和防氧化。4℃，以密度1.019,30000r/min，超速离心18小时。吸出上薄层乳白色液体极低密度脂蛋白（VLDL)及次层淡黄色液体中间密度脂蛋白（IDL)；再以密度1.063,4℃ ,40 000r/min，离心24小时，上层黄色液体即为LDL。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为同一区带，4℃下，在含10mg/L EDTA的磷酸缓冲液（PBS)中透析72小时，过滤除菌，4℃保存备用。

2．氧化低密度脂蛋白（_oxLDL）的制备和鉴定将LDL在含10umol/L CuSO₄的PBS中，37℃，氧化12小时，然后于4℃，在含l00mg/L EDTA的PBS中透析，每8h换液一次，透析24小时。用硫代巴比妥酸反应物质（thiobarbituric acid reactive substance, TABRS）的含量鉴定_oxLDL。即将样品或丙二醛标准品0.1 ml加于2.9 ml复合液（含 CCL₃ COOH 0.92mol/L,C₄H₄N₂O₂S O.02mol/L, HC1 0.25 mol/L）中，于100℃水浴放置30分钟，冷却后测定在532nm的OD值，计算TBARS含量，再以TC试剂药盒测LDL-C含量。Ch的氧化修饰程度以每克Ch的TBARS含量表示。

3．巨噬细胞的收集与培养参考Leonard等的方法收集巨噬细胞。即取30只C₅₇BL/6J雄性小鼠、10周龄、体重23.9± 2.5 g，腹腔注射无血清培养基RPMI 1640 2m1,4天后注射RPMI 1640 4ml收集腹膜巨噬细胞，以109/L的密度种植于培养瓶中培养12小时，弃培养液，用PBS冲洗掉未贴壁的细胞组分，重复3次。分别加入空白对照培养液（含10％胎牛血清的RPMI 1640)，含_oXLDL 10mg/L的培养液4ml，继续培养96小时。

4．血管SMC的培养无菌状态下取猪胸主动脉，剪去外膜脂肪，分别用PBS,D-Hanks液冲洗，0.25%胰酶消化除去内皮细胞，剥下中膜，剪碎，用常规组织贴块法培养（37℃,5% C0₂，饱和湿度），待SMC长出后冲掉组织块，在30ml培养瓶中传代培养，培养基均为含20%小牛血清的M199。

5．细胞的形态学观察将贴壁于盖玻片SMC取出，以PBS冲洗3次，于4℃ ,10％甲醛中固定24小时，用油红0方法染色。方法为：①水洗5分钟；②在60％异丙醇中放置5分钟；③用新过滤的油红0（储备液含0.5％油红0,98％异丙醇，用前以水稀释成40%;24小时后过滤）染色10分钟，用60％异丙醇分化5分钟；④水洗5分钟；⑤用Mayer苏木精明矾液染色5分钟，该染液含苏木精0.1%、碘化钠0.02%、钾矾5%、水合氯醛5%、枸橼酸0.1%；⑥水洗30分钟；⑦干燥封片。在倒置显微镜下观察，并以10x100倍作彩色照相。

6．细胞内胆固醇(Ch)的测定用0.25%胰酶消化1分钟，收集细胞，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用PBS冲洗一次，加入异丙醇0．5 ml，在CQ250超声波清洗器上震动10秒／分钟x3次，再以1000r/min离心15分钟。吸取上清液用总胆固醇( total cholesterol, TG )试剂药盒及游离胆固醇(free cholesterol, FC )试剂药盒分别测定其TC和PC,并蒋其离心沉淀物用0.lmol/L NaOH 0.5m1裂解细胞，用Lowry法侧定细胞蛋白含量。细胞内的Ch含量以TC/g细胞蛋白和FC/g细胞蛋白表示，两者之差即为CE/g细胞蛋白含量。

【注意事项】

1．所用试剂均为AR级以上。

2．收取血清样品应从速，最好使用新鲜血清。

3．超速离心的添加样品和取样时均应仔细操作，尽量减少机械扰动。

4．血清密度调节的公式为：

注：式中Vn为需加入的高密度液体积（ml) ;dn为需加入的高密度液的密度（g/ml) ; do为密度调节前血清的密度（g/ml) ;dm 为需调节的密度（g/ml) ;V。为密度调节前血清的体积（ml)。

【方法评价】

在众多的小鼠品系中并非所有品系的小鼠都在一定条件下形成特征性AS斑块，本方法所采用的C57BL/6J小鼠（系中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供）较易形成典型的病变，在_0XLDL环境中易形成泡沫细胞。

动脉中膜SMC具有较强的摄取脂质能力及良好的传代性，可作为复制泡沫细胞的实验材料，且以猪主动脉中膜SMC较为适宜，但由于采用常规组织贴块法培养，需等原代长出SMC后方可传代，再进行泡沫细胞模型的复制，故所需时间较长。