破骨细胞的主要生物学功能是黏附于矿化骨基质表面，在局部形成皱褶缘，由泌酸和分泌蛋白水解酶侵蚀吸收骨基质。骨吸收是由破骨细胞介导，通过复杂的分子机制完成的。骨吸收抑制药的药效表现在破骨细胞生成和骨吸收功能受抑制。所以以破骨细胞为模型，研究药物对其分化、成熟及功能的影响，对于开发出有效的针对骨吸收亢进的药物具有重要的意义。

【材料】

1．动物新生（1～3天）SD或Wistar大鼠。

2．试剂

（1）75％乙醇；

(2) MEM培养液；

(3）2.5％戊二醛；

(4) TRAP孵育液386-A,leukocyte acid phosphatase Kit,Sigma试剂盒；

(5) Annexin-PI孵育液Annexin V-FITC (A9210, Sigma试剂盒）；

(6) Binding buffer缓冲液Annexin V-FITC (A9210, Sigma试剂盒）；

(7）0.25mol/L氢氧化铵。

3.其他材料

组织培养瓶;96孔培养板；37℃水浴箱;5% C0₂培养箱；荧光显微镜，光学显微镜。

【方法】

1.破骨细胞的分离与制备

(1)取新生（1～3d) SD或Wistar大鼠，处死后75％乙醇浸泡5分钟，快速分离四肢长骨。

(2)在含有双抗的缓冲溶液中剔净软组织并去除软骨骺，纵向剖开骨干，机械刮切吹打制备细胞悬液，冰浴中备用。

(3)吸取上层细胞悬液均匀接种于预置有象牙薄片或牛骨片的96孔培养板中，37℃ ,5% CO₂条件下培养，3d更换1次培养液。

2．破骨细胞骨吸收抑制药药效的测定

(1) TRAP阳性多核细胞计数细胞悬液移入预置骨片的96孔细胞培养板（100微升／孔）置5% C0₂,37℃培养箱培养30分钟，用MEM冲去未贴壁细胞，加入培养液继续培养30分钟，更换含不同浓度药物培养液，对照培养孔更换等量不含药的培养液，每24小时换液50%。培养72小时后取出含细胞骨片，2.5％戊二醛4℃固定后放入TRAP孵育液内，37℃孵育50分钟，蒸馏水冲洗，甘油明胶封片，光镜观察，计数TRAP染色阳性多核（≥2个）细胞，计算药物对TRAP阳性的多核破骨细胞数的抑制率（图11-26)。

(2）破骨细胞凋亡率在预置培养骨片的96孔细胞培养板中培养的破骨细胞，经不同浓度药物培养4～6小时，取出骨片，Binding buffer缓冲液冲洗后，经Annexin-PI孵育液（5 ul Annexin V-FITC）和5ul PI室温暗室孵育5～10分钟，快速置荧光显微镜下观察计数。

(3)骨片吸收陷窝形成抑制率细胞悬液移入含骨片的96孔细胞培养板培养5小时，更换含不同浓度药物培养液，对照培养孔更换等量不含药物的培养液，每24小时更换50%，连续培养至72小时。取出骨片，2.5％戊二醛固定7分钟，于0.25 mol/L氢氧化铵中超声清洗5分钟x3次，乙醇脱水，自然晾干后1％甲苯胺蓝室温染色3～4分钟，蒸馏水清洗。100倍光镜下观察和拍摄整张骨片（4视野／片）。

(4）破骨细胞数量和功能的生化指标检测细胞悬液移入预置骨片的96孔细胞培养板（100微升／孔），置于5% C0₂,37℃培养箱培养30分钟，用MEM冲去未贴壁细胞，更换含不同浓度药物培养液，对照培养孔更换等量不含药培养液，每24小时换液。培养72小时后，采用试剂盒检测培养液中TRAP含量。

【结果与分析】

l. TRAP阳性多核细胞计数 计算药物对TRAP阳性多核破骨细胞数的抑制率。

药物在某一时相点对TRAP阳性多核破骨细胞数的抑制率为：

（n对照组TRAP阳性多核破骨细胞-n药物组TRAP阳性多核破骨细胞）/n对照组TRAP阳性多核破骨细胞×100(％）

2．破骨细胞凋亡率凋亡破骨细胞为绿色荧光、多核和体积大；坏死破骨细胞为红色荧光、胞体肿胀。结合TRAP染色光镜观察，计数每片TRAP染色阳性多核细胞，计算破骨细胞凋亡率，比较药物组和对照组破骨细胞凋亡率的差别。可计算药物对破骨细胞凋亡率的促进作用。

3．骨片吸收陷窝形成抑制率100倍光镜下观察和拍摄整张骨片（4视野／片），计算机辅助计量骨吸收陷窝数或面积，每时相点计量不少于5张骨片，以平均陷窝数（n)或吸收面积（S）表示。

计算药物在某一时相点对破骨细胞骨片吸收陷窝形成的抑制率即（n对照组-n药物组）/n对照组x100(％）或（S对照组-S药物组）/S对照组、100(％）骨片吸收陷窝识别指标为：紫色或蓝紫色染色，形态为圆形、椭圆形、腊肠形，边界清晰，底部粗糙等，如单纯陷窝计数须确定相对一致的大小范围。

4．破骨细胞数量和功能的生化指标检测比较药物组和对照组破骨细胞数量和功能的改变。计算药物对破骨细胞骨吸收功能的干预作用。

依据对破骨细胞分化成熟的抑制，促进凋亡和骨吸收活性的抑制等指标，可综合评价骨吸收抑制药效。

【注意事项】

采用机械分离的方法，每只新生大鼠可获得数百个破骨细胞。由于骨组织中破骨细胞含量少、代谢旺盛，对环境因素较敏感，在分离培养过程中易受损伤，获得足够量实验需要的培养破骨细胞有一定难度。低温快捷操作可减少破骨细胞损伤和分离容器黏附。诱导形成破骨细胞样细胞的方法相对简单，而且诱导形成的破骨细胞样细胞数量多，但是需要其他细胞参与，显然不利于阐明药物的作用靶细胞及作用机制。