体外抗骨质疏松药物的实验研究模型是应用体外培养的骨细胞（成骨细胞、破骨细胞）模型对抗骨质疏松症药物的药效和药理特点进行初步研究，为临床前体内药效和临床药效研究提供参考依据。对体外培养的成骨细胞和破骨细胞分别进行骨形成促进作用和骨吸收抑制作用研究，是抗骨质疏松症药效研究的重要内容之一。

自1964年Peck由胚胎和新生大鼠头盖骨应用酶消化法体外培养出显示高活性碱性磷酸酶( alkalinephosphatase, ALP）的成骨细胞（osteoblasts, OB）和1984年Boyde等建立体外培养破骨细胞（osteoclasts, OC）及其骨吸收功能测定等技术以来，实验技术得到迅速发展，不仅促进了骨重建耦联分子机制研究、骨代谢基础研究和代谢性骨病病理机制研究的进展外，还有力地推动了骨质疏松症防治药物研究的发展。雌激素、降钙素、活性维生素D和甲状旁腺激素等一些药物对骨质疏松症防治的有效性和作用机制研究均与骨细胞体外培养实验研究密切相关。在评价骨质疏松症防治药物的有效性中，观察所研究药物对成骨细胞骨形成功能的促进作用和对破骨细胞骨吸收功能的抑制作用是药效评价的重要内容之一，因而建立规范的骨细胞体外培养和骨细胞药效研究技术在骨质疏松症防治药物开发中十分重要。

一、成骨细胞骨形成促进药药效实验

【原理和目的】

成骨细胞的主要生物学功能是形成类骨质和矿化形成新骨质。成骨细胞是骨形成细胞，在骨重建中生成类骨质和促进类骨质矿化，形成的新骨质可修补破骨细胞骨吸收形成的陷窝。成骨细胞功能减退导致新骨形成量减少，对骨吸收陷窝的修补能力减弱。因此，成骨细胞骨形成的促进药物是防治骨质疏松症的主要途径之一。而促进骨形成的药效表现在骨形成细胞数量增加、分化合成功能和矿化功能上调。

【材料】

1．动物 新生大鼠（SD或Wistar，清洁级合格）10只。

2．试剂

（1）70％乙醇；

(2) PBS磷酸缓冲液；

(3) 0.25%胰蛋白酶溶液；

(4) 0.1% II型胶原酶溶液；

(5) 10% NCS-MEM培养液；

(6) 0.5% MTT(PBS溶解配制，棕色瓶4℃保存）；

(7) 10% SDS(O.Olmol/L HCl配制）；

(8）底物反应液：PNPP-DEA溶液MgC1₂·6H₂0 101.7mg,12N HCl 1.95ml, DEA 10m1加蒸馏水至50m1;临用前与3mmol/L PNPP等量配制；

(9）茜素红。

3．其他材料50m1烧杯；组织培养瓶；96孔培养板；24孔培养板；离心机；5% C0₂培养箱；酶标仪，光学显微镜。

【方法】

1．成骨细胞的分离与制备

(1)取新生大鼠（SD或Wistar，清洁级合格）10只左右，体表清洗后置70％乙醇中浸泡10分钟。

(2）揭去头皮，切下头盖骨，将头盖骨置于磷酸缓冲液（PBS)内。清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS清洗2次后，将洗净的头盖骨剪成1 mm2小片。

(3)将骨小片移入5 ml 0.25%胰蛋白酶溶液内，37℃下预消化20分钟，弃消化液。将骨片移入另一含5ml 0.1 % II型胶原酶溶液中，37℃振荡消化分离细胞60分钟。

(4）将含细胞的消化液离心10分钟，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液，剩下的骨片用含5 ml 0.1 % II型胶原酶溶液重复消化分离细胞60分钟。将2次消化获得的细胞悬液混匀，计数。

(5)按需要密度接种于培养瓶中，置5% CO₂培养箱中培养。24小时左右换液一次，去除不贴壁的死亡细胞，以后每2～3天换液一次。

2．成骨细胞骨形成促进药药效的测定

(1)增殖率测定：将培养呈半汇合状态的成骨细胞经0.25%胰蛋白酶消化后传代，10% NCS-MEM培养液重悬计数，以相同细胞密度（1x10³～2x10³／孔）接种于96孔培养板，容积为200～250微升／孔，常规培养24小时，待细胞贴壁后换入含药物或含溶剂对照培养液培养,72小时后用MIT法测定。测定前4小时用PBS冲洗后更换无血清MEM培养液100ul，同时加入10ul 0.5 % MTT (PBS溶解配制，棕色瓶4℃保存），培养箱孵育4小时，加100ul 10% SDS (0.01 mol/L HCl配制）37℃下孵育2小时。孵育后肉眼己可见不同数量的细胞呈现不同深浅的紫色，冷至室温后在酶标仪上（波长570nm处）测定吸光度值（A)。

(2) ALP活性的测定：将培养呈半汇合状态的成骨细胞经0.25％胰蛋白酶消化传代，10% NCS-MEM培养液重悬细胞、计数，以相同细胞密度（1X10³～2x10³／孔）接种于96孔培养板，容积为200～250微升／孔，常规培养24小时，待细胞贴壁后换入含药物或含药物溶剂对照培养液培养72小时后用PNPP法测定。取培养液20ul于96孔板，加底物反应液90ul，37℃水浴10分钟，加0.1mol/L NaOH 90u1终止反应。在酶标仪上（波长405nm）测定吸光度值（A)。调零孔为90 u1反应液+90ul终止液+20 ul培养液。

(3）矿化结节计数：培养细胞以5x10³/cm²密度接种于24孔培养板，次日换入含药物或含药物溶剂对照培养液培养，2～3天换液一次，10天左右添加维生素C和β-甘油磷酸钠诱导矿化，一般以溶剂对照组出现矿化结节为准终止培养，茜素红染色，40倍光镜下做形态计量分析（图11-25）。

【结果与分析】

1．增殖率测定孵育后肉眼已可见不同数量的细胞呈现不同深浅的紫色，冷至室温后在酶标仪上（波长570nm处）测定吸光度值（A) 。

细胞量与MTT A值呈正相关。成骨细胞增殖促进率计算：

（A药物组-A对照组）/A对照组x100(％）。

增殖率采用MTT法测定含药物培养液、溶剂对照培养液培养72小时后的成骨细胞增殖率，并绘制生长曲线，可比较药物对细胞生长的促进作用。

2. ALP活性的测定样品A值在ALP标准曲线上读取酶活性值（U/L) (PNP浓度梯度5 umol/L,10 umol/L, 20umol/L , 40umol/L相当于ALP 20U/L,40U/L,80U/L,160U/L)。

分化促进率计算方法：（Z药物组ALP-Z对照组ALP)/Z对照组ALPxl00（％）。

分化能力应用对硝基苯磷酸盐法（PNPP)检测含药物培养液、溶剂对照培养液培养72小时后的培养液中的ALP含量，以其与对应样品蛋白的比值分析成骨细胞的分化活性，计算药物成骨细胞分化促进率。

3．矿化结节计数 以矿化结节数（n)或矿化面积（A）作为指标。计量标准：以＞2um2/个为标准。矿化促进率计算：
（n药物组-n对照组）/n对照组x100(％）或（A药物组-A对照组）/A对照组x100（％）矿化能力应用矿化诱导法和茜素红法，对含药物培养液、溶剂对照培养液培养约10天后出现的矿化结节列入计数，进行形态计量，计算药物成骨细胞矿化结节促进率。

最终结合这三种指标，可分析抗骨质疏松药物药效表现为以促进增殖为主，或是以促进分化和矿化能力为主。可综合判断药物的骨形成促进药效。

【注意事项】

1．一般采取酶消化法或组织块培养法（细胞移行生长法）。前者可获得大量细胞，但如消化酶的量或效价不足则不能获得理想的细胞数量，另外如果酶的浓度、温度以及消化时间掌握不当可能会导致细胞损伤、膜受体的丢失，对细胞的贴壁和成活率也有一定影响；后者方法比较简便、实验成本较低且细胞损伤小，细胞较纯，但细胞产出率比较少。

2．原代分离的成骨细胞多含有其他细胞，如成纤维细胞、软骨细胞等；而且随着传代次数增加，成骨细胞将会去分化而丧失某些原有特性。以2～3继代培养细胞为适。

3．试验前需对培养的细胞进行骨形成功能鉴定，应用增殖能力、ALP活性和矿化结节形成能力等指标对所研究药物的骨形成促进作用进行有效性评价。其细胞药效试验应重复进行3～5次，以综合判断药物的有效作用。