翠丸组织主要包括3种细胞：生精细胞、间质细胞及支持细胞。生精细胞的主要功能为产生精子，间质细胞的主要功能为合成和分泌雄激素，而支持细胞是肇丸生精上皮的重要组分之一，在生精细胞的增殖、分化和发育过程中具有重要作用。具有诱导免疫豁免及对间质细胞的营养支持作用，可调控间质细胞的功能。因此，这三种翠丸组织细胞的培养对于研究人类生精细胞的特性，为解决无精子症患者的治疗奠定理论基础和提供实验方法、研究睾丸间质细胞的基本生物学功能及研究间质细胞与支持细胞的相互影响都具有重要意义。

【材料】

1．动物 SD雄性大鼠。

2．胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶、BSA, DMEM,199培养液、LH、小牛血清（neobornbull serum,NBS), DMEM/Fl2培养基（将DMEM培养液与F12培养液以1:1体积比配制成DMEM/F12培养液，应用前加入2mmol/L的L-谷氨酰胺和20％体积的灭活后小牛血清）。

3.混合气体（5% CO₂+95% 0₂）、离心机。

【方法】

1．生精细胞的分离和培养 选用90日龄SD雄大鼠，无菌条件下，摘取睾丸，去包膜，将睾丸组织剪碎成1～2mm大小，加入相当于睾丸组织量10倍体积的0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA液中，在37.0℃恒温水浴箱中消化3～5分钟，期间吹打数次。当睾丸组织被消化成长约2～3mm的生精小管片段时，加入含10% NBS培养液，终止消化。以1000r/min离心3分钟，弃上清液，重复2次，以去除消化酶。加入适量培养液，用两片消毒的玻片不断地研磨生精小管片段，直到形成细胞混悬液状，加入1～2ml培养液，稀释并吹打成均匀的单细胞混悬液。用DMEM洗2次，重新混悬在含有0.5% BSA,lmmol/L EDTA,O.5mmol/L葡聚糖钠和5mmol/L乳酸钠的Han's F12/DMEM中，收集并过滤得到较纯的生精上皮细胞，再用F12/DMEM洗2次，再用含10^-7 mol/L的睾酮、1Ommol/L乳酸钠、0.7mmol/L丙酮酸钠和2mmol/L L-肤胺的F12/DMEM混悬，计数细胞，稀释至1x10⁶/ml，置于l00mm培养皿中培养，每天更换培养液一次，24小时后，生精细胞贴壁展开，镜下观察。加入含待测药物的新鲜培养液。一般药物作用72小时后，终止实验。

2．间质细胞的分离与培养选16～18日龄的雄性SD大鼠，消毒后打开腹腔，于膀胱游离完整睾丸，将睾丸放入已消毒并于冰上预冷的培养皿中。在解剖显微镜下小心剥除白膜并将生精小管轻轻拨散，尽量不损伤生精小管的连续性，将生精小管置于含有0.03% 1型胶原酶的DMEM/F12培养液中，吸管轻轻吹打10分钟，使生精小管散开呈絮网状，然后加入等量冰上预冷的培养液终止消化。静置4分钟；吸取上清液，用100目不锈钢网过滤，收集过滤液，1000r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀物用DMEM/F12培养液制成细胞悬液，用血细胞计数板计数。按每孔（1～2)x10，个细胞接种于24孔培养板，或(5～8)x10，个细胞接种于35mm培养碟中。置37℃,5% C0₂培养箱中培养。24小时贴壁后，更换培养液，去除悬浮的细胞碎片，再加入不同浓度的待试药物继续培养。

3．支持细胞的分离和培养雄性SD大鼠切开腹腔，于附睾尾部附着处剪断部分睾丸被膜，将睾丸组织剥离出被膜，置于盛有生理盐水的培养皿中，去除血管，反复冲洗。将睾丸组织置于含0.05%胰蛋白酶的消化液中10～20分钟，以消化去除间质细胞及类肌细胞等杂细胞，并用眼科镊子反复拨动使其散开，用滴管反复吹打，小牛血清终止消化，800r/min离心分钟去除胰酶。0.1 % N型胶原酶37℃ ,5% C0₂条件下消化30～60分钟，直至残存的睾丸组织变为溶液状将消化后组织通过200目不锈钢网筛，以去除尚悬浮于上清液的胶原组织、血细胞、间质细胞和精原细胞。加入DMEM/F12培养液调整细胞浓度为1x10⁵/ml将细胞植入24孔培养板中，细胞培养24小时后，支持细胞均已贴壁展开，显微镜下观察几乎无其他细胞混杂，更换培养液，除去悬浮的细胞碎片，并加入受试药物继续培养。

【结果与分析】

以细胞存活率或细胞形态改变为指标，观察待测化合物对生精细胞的直接作用。一般以细胞的存活率、细胞的形态变化和细胞在hCG刺激下，内源性地合成、分泌睾酮到培养液的含量为指标，观察和分析测试药物对间质细胞的抑制作用。以细胞存活率、细胞形态变化以及在FSH刺激下支持细胞中的芳香酶将雄烯二酮转化成雌激素的能力为指标，观察测试化合物对支持细胞的抑制作用。

【注意事项】

1．生精上皮细胞的分离、纯化技术要求较高。获得较纯的生精上皮细胞是做好生精细胞培养的关键。

2．间质细胞在消化过程中尽量在4℃下操作，减轻对细胞的损伤，使活细胞数量增加，细胞贴壁过程加快、生长旺盛。

3．获得高纯度支持细胞是培养的关键，在消化过程中在操作过程中应密切注意胶原酶作用的时间。