造血干细胞（hematopoietic stem cell)是血细胞的起始细胞，具有自我更新和进一步分化为各系血液细胞的能力。造血干细胞存在于骨髓、外周血、胚胎肝及脐带血中。造血干细胞移植治疗白血病和恶性肿瘤是通过大剂量放、化疗预处理，清除受者体内的白血病或肿瘤细胞，再将自体或异体造血干细胞移植给受者，使受者重建正常造血及免疫系统。造血干细胞移植已广泛应用于白血病、恶性淋巴瘤和某些实体瘤的治疗，并获得了较好的疗效，已成为根治白血病和某些实体瘤的主要手段。

【材料】

1．组织来源 异体的骨髓与外周血，或脐带血。

2．造血干细胞采集、分离用试剂：生理盐水、肝素、G-CSF, Ficoll-hypaque分层液、利多卡因。

3．实验器材 骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，倒置显微镜，净化工作台，流式细胞仪，荧光显微镜，热合仪，洁净服，一次性无菌纸巾，20ml一次性注射器，无菌口罩，无菌帽子，无菌手套等。

【方法】

1．不同来源的造血干细胞比较，见表12-3。

2．取材

(1)骨髓造血干细胞采集：供者术前不要食油腻食物，采集前12小时应禁食、禁水。供者进入手术室，硬膜外麻醉或1％的利多卡因在双侧的骼骨上棘部位作局部麻醉，骨髓穿刺针穿刺入骨髓后，采集骨髓血。用预先加入肝素的注射器采集骨髓血。在骼前上棘和骼后上棘，多位点 多方向、多层面穿刺抽吸骨髓血。骨髓血采集量由供者的有核细胞数和患者的体重决定，单独异基因骨髓造血干细胞移植所需要有核细胞应达到3x10⁸/kg体重以上，采集骨髓血约300～400ml。采集后包扎穿刺点，病房内去枕平卧6小时。

(2）外周血造血干细胞采集：供者需要注射4～6mg/kg的G-CSF进行造血干细胞动员，动员后的第5～7天进行外周血造血干细胞采集。造血干细胞的采集在血液细胞分离室进行。经血细胞单采仪将造血干细胞收集到贮血袋中，采集过程一般需要4小时左右，循环处理血量不少于10 000m1。医生将根据每次采集的细胞数量来决定采集次数，一般不超过2次。采集的造血干细胞应尽快回输或置于-80℃或液氮中保存。

(3）脐带血的采集：新生儿出生后，在近婴儿与近母端分别用两把止血钳结扎，剪断脐带。抱走新生儿后，在脐带近母端止血钳处消毒脐带并将针头插入，采集脐带血。

3．细胞分离 HLA配型与ABO血型均相合供者造血干细胞可直接移植，不需要分离细胞，但在下述情况下需要特殊处理。
(1)供、受者HLA配型相合而ABO血型主交叉反应不合时，采集的造血干细胞悬液应做去除红细胞与血浆处理，以免出现溶血反应。

具体方法：将干细胞悬液与6%羟乙基淀粉溶液按1：3比例混匀，室温下静置30分钟，使红细胞在重力作用下自然沉降。收集上层液并移入离心管中。4℃,2200r/min离心5分钟，弃上清液。加入5 ml生理盐水，轻轻拨打离心管，使底部细胞混匀，将细胞收集到一个50m1离心管中，加入生理盐水至50ml。另取离心管，分别加Ficoll-hypaque分离液7ml至每支管中。将干细胞悬液沿管壁缓缓加于每支离心管的细胞分离液的表面，室温、1800r/min离心20分钟。收集单个核细胞层细胞，将单个核细胞移入另一离心管。加入盐水，4℃,2200r/min离心5分钟，重复3次。用生理盐水将细胞调成一定浓度，取300ul细胞悬液用于细胞计数和CD34阳性细胞率测定，其余细胞用于移植。

(2)供、受者HLA配型相合而ABO血型副交叉反应不合（即供者具有受者不具备的血型抗体），若供者的血型抗体滴度高于1:256时，可导致不同程度的溶血，要做弃去血浆处理。

具体方法：将干细胞悬液移入离心管，4℃,2000r/min离心5分钟，弃上清液。加入生理盐水混匀，4℃,2000r/min离心5分钟，重复1次。用生理盐水将细胞调成一定浓度，取少量细胞悬液用于细胞总数和CD34阳性细胞率检测，其余细胞用于移植。

4．细胞鉴定造血干细胞以CD34⁺,CD38^-及HLA-DR-为表型特征，采用流式细胞仪对造血干细胞进行鉴定。

5．临床应用

(1)移植前受者的准备：患者要进行全面查体，准备在洁净病房内所用的生活用品，并剃掉头发。

(2)预处理：在造血干细胞移植前，患者须接受预处理，此过程为造血干细胞移植治疗的中心环节之一。根据疾病的类型选择不同的预处理方案。

1)白血病常用的预处理方案有Cy/TBI（环磷酰胺+全身照射）,Bu/Cy（白消安+环磷酰胺）和Bu/Flu白消安+氟达拉滨）等。

2）恶性淋巴瘤常用的预处理方案为CBV（环磷酰胺+卡莫司汀+依托泊苷）或BEAM（卡莫司汀+依托泊苷+阿糖胞苷+美法仑）。

3)多发性骨髓瘤的预处理方案多选择大剂量注射马法兰。

预处理强度可分为清髓性预处理和减低剂量预处理。清髓性预处理多采用联合化疗药物的超大剂量的化疗，有时需配合放疗来达到预处理的目的。这种预处理方式能够最大限度地清除体内的残留病灶以减少基础疾病的复发，对于耐受性较好、年轻的白血病和恶性肿瘤患者，主张采用清髓性预处理方案。Cy/TBI和Bu/Cy是最为经典的清髓性预处理方案。减低剂量预处理方案所应用的化疗和放疗剂量都比较小，其主要目的是抑制受者的免疫反应，便于供者细胞的植入，以形成供受者嵌合体。此种预处理方案的毒副作用较小，适于疾病进展缓慢、肿瘤负荷小、年龄大或重要脏器功能异常的患者。减低剂量预处理方案常使用免疫抑制作用较强的药物，如氟达拉滨及抗胸腺细胞免疫球蛋白等。减低剂量预处理方案处理后残存的肿瘤细胞较多、移植后基础疾病复发和出现患移植物抗宿主反应的机会较大。

(3)造血干细胞移植：骨髓血或外周血造血干细胞可通过外周静脉或中心静脉输入，所用输血器中不应有过滤网。采集的造血干细胞应尽量在采集后4小时内输完，冻存的造血干细胞在40℃水浴快速解冻后，应尽快输注。

【结果】

造血干细胞移植成功，血细胞数可呈现持续下降后回升。中性粒细胞连续3天超过0.5x10⁹/L为白细胞植活的标志；在不进行血小板输注的情况下，血小板计数连续7天大于20x10⁹/L为血小板植活标志。

造血干细胞植活鉴定：可根据供、受者之间性别、红细胞血型或HLA的不同，分别通过细胞学和分子遗传学实验方法获得植活的实验室证据。对于上述三项均相合者，则可采用短串联重复序列（STR)、单核苷酸序列多态性（SNP）结合PCR技术分析取证。

【注意要点】

1．造血干细胞移植可能出现致命性并发症，因此要严格把握造血干细胞移植的适应证。造血干细胞移植的适应证包括：

(1)血液系统恶性肿瘤：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等；

(2)其他实体瘤：乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、小细胞肺癌等。

2. HLA配型是造血干细胞移植成败的关键。目前通过HLA-A,B,C,DRB1等基因检测进行供、受者HLA配型，同胞之间HLA全相合者为首选，亲属之间HLA不全相合（半相合）者也可以选择。无血缘关系的造血干细胞移植对供受者之间HLA配型相合程度的要求很高，全相合的供者才能移植。否则会发生严重的排斥反应。由于新生儿免疫系统发育的不成熟，脐血造血干细胞移植对HLA配型相合程度的要求较低，一般4/6相合即可移植，但需要细胞数较多的脐血或双份脐血同时移植。

3．用肝素抗凝的干细胞悬液输注时要辅以鱼精蛋白，鱼精蛋白的用量为每100单位肝素加1 mg鱼精蛋白。

4．造血干细胞移植后的输血为确保受者安全，采用成分输血维持血小板不低于20x10⁹/L，对有活动性出血或需要进行有创性操作时，血小板应维持在50x10⁹个／L以上，血红蛋白应维持在70g/L以上。为避免输血后的移植物抗宿主病（GVHD）的发生，所有血制品必须先进行照射（15～20Gy）以灭活T淋巴细胞，或用白细胞过滤器以去除淋巴细胞。

5．移植物抗宿主病的预防 供者T淋巴细胞受到受者抗原刺激后被活化，进而攻击受者组织和器官而致免疫损伤，是异基因造血干细胞移植术后的主要并发症。移植物抗宿主病的预防包括：①免疫抑制剂的应用：常用的免疫抑制剂包括环抱素（CsA )、他克莫司(FK506)、甲氨蝶呤(MTX)、吗替麦考酚酯（霉酚酸醋，MMF) ,CD25单克隆抗体等。②移植物T细胞清除：半相合供者造血干细胞移植，多在体外进行T淋巴细胞清除，以防止移植物抗宿主反应的发生。

6．造血干细胞移植患者的护理

(1)人住洁净病室前对患者的处理：①人室物品必须进行消毒：需要对衣被、药品、食具、便器、书报等进行消毒，以防外源性感染；②患者的全面检查：特别要注意检查有无感染灶，发现感染应该积极治疗，彻底清除慢性和潜在的感染病灶；③人室前修剪指（趾）甲、理发。入室当天清洁灌肠。淋浴后进行1：2000氯己定液药浴30分钟，更换无菌衣裤、鞋、帽，戴无菌口罩，然后进入百级层流病室，入室后不得擅自走出超净区；④静脉置管：移植前1天行锁骨下静脉置管术，备用。

(2）层流病房环境保护：①百级无菌层流病房用消毒清洗剂擦拭，1次／天。室内空气用0.8％过氧乙酸喷雾消毒，1次／周。②食用无菌饮食：做熟的饭菜、饮料经微波炉高火消毒后食用，餐具每次消毒。水果经1:2000氯己定液浸泡消毒30分钟后去皮食用。口服药片经紫外线正反照射各30分钟后供患者服用。③肠道消毒：每天口服不吸收抗生素如小檗碱等。④皮肤消毒：清洁皮肤表面，1次／天。1%氯霉素、0.5％利福平眼药水交替滴眼，2次／天。75％乙醇棉签擦外耳道，3次／天。便后清洗或坐浴，75％乙醇喷手清洁。

(3)注意造血干细胞移植患者的饮食与饮食搭配。