股骨头坏死、关节软骨损伤等是常见的关节功能障碍性疾病。关节骨的自身修复能力很差，关节骨一旦坏死或损伤很难修复，继而会发生不可逆的病理变化，造成关节的退行性改变，严重影响患者的生活质量。自体骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头坏死或关节软骨损伤，是近年发展起来的新疗法，将自身间充质干细胞或定向分化的骨与软骨细胞移植到骨关节病病灶处，能促进病变骨关节内新骨形成，进而修复病灶，使骨关节恢复正常。

【材料】

1．组织来源骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．骨及软骨细胞定向分化培养用试剂生理盐水、0.25%胰蛋白酶-EDTA混合消化液、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、TGF-β、丙酮酸钠、胰岛素、转铁蛋白、肝素。

3．培养基配方和制备无血清培养基。

4．实验器材二氧化碳培养箱、低温离心机、电动移液器、一次性刻度吸管、50ml离心管、15 ml离心管、骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪、75cm²培养瓶。

【方法】

1．取材采集自体骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织、脐带间充质干细胞的分离方法。

3．接种培养

(1)间充质干细胞向成骨细胞定向分化诱导培养：采用无血清培养基（可含10％供体灭活血浆）将细胞调成悬液，按2x105/cm2接种于培养瓶，置37℃,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养，每3天换液，待细胞覆盖瓶底85％～90％时常规方法消化并传代。传代2次，待细胞长满后，吸净培养上清，加入含50 ug/ml维生素C,1Omol/L地塞米松及5mol/Lβ-甘油磷酸钠的无血清培养基，37℃,5% CO₂条件下培养2周。吸取5ml上清液进行检菌实验，然后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，将细胞悬液进行1800r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，1800r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

(2）软骨细胞定向分化诱导培养：采用无血清培养基（可含10％供体灭活血浆）将细胞调成悬液，按2x10⁵/cm²接种于培养瓶，置37℃,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养。每3天换液，待细胞覆盖瓶底85％～90％时常规方法消化并传代。连续传3代，待细胞长满后，吸弃培养上清液，加入含5～lOng/ml的TGF-β,1 mmol/L丙酮酸钠、10mmo1/L地塞米松、6.25 ug/ml胰岛素、6.25 ug/ml转铁蛋白的无血清培养基，37℃,5% C0₂条件下诱导培养3周。取上清液作检菌实验，用胰蛋白酶消化细胞，细胞悬液1800r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，1800r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

4．细胞表型特征间充质干细胞分化为骨细胞后碱性磷酸酶、Vonkossa染色阳性，ALP, Osteocalcin及Osteopontin基因表达；分化为软骨细胞后阿尔新蓝（Alcian Blue）染色阳性，表达Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和聚蛋白聚糖（aggrecan)。

5．应用

(1)股骨头坏死的治疗：可通过导管介入技术将间充质干细胞或成骨细胞注入缺血区，或采用髓芯减压与干细胞移植联合及采用干细胞复合支架等技术对股骨头坏死进行干细胞治疗。髓芯减压加干细胞移植是常用的治疗方法。髓芯减压术可为股骨头充分减压，刮除硬化骨和囊性变区，为骨再生创造条件。间充质干细胞可促进病变股骨头内血管再生，改善股骨头坏死区及周围组织血液循环，促进血管再生。

(2）软骨损伤的治疗：采用关节腔内注射或采用干细胞与复合支架构建的工程化软骨移植等方式治疗软骨损伤。关节腔直接注射干细胞能促进半月板的修复。另外，将干细胞接种到具有良好的生物相容性的支架上构建工程化软骨，工程化软骨植入体内后，支架材料逐渐降解并为细胞分泌的外基质所替代，从而修复损伤。

【结果】

1．间充质干细胞向成骨细胞定向分化诱导培养结果诱导培养24小时间充质干细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈梭形；培养3～4天可见细胞呈集落生长，细胞呈放射状向外分布，细胞呈梭形或多角形。加入成骨细胞分化诱导培养基14天后，分化的干细胞呈典型的成骨细胞形态，碱性磷酸酶染色呈阳性或强阳性，胞质中出现黑色、灰褐色颗粒或片状沉淀，I型胶原、骨钙素表达阳性，茜素红染色可见钙结节形成。

2．软骨细胞定向分化诱导培养结果原代培养3天细胞形成多个集落，集落大小不均，中心部位可叠层生长，分布较密，外围细胞呈放射状向外分布，培养7～10天细胞融合为单层，单个细胞呈长梭形，细胞排列呈旋涡状。加入软骨细胞分化诱导培养基后，细胞增殖变缓，细胞由梭形逐渐变为多角形。

3．成骨细胞移植结果临床研究结果显示，间充质干细胞或成骨细胞移植治疗早期股骨头坏死，能够缓解疼痛、阻止病变进展。可出现关节塌陷好转、疼痛减轻、关节功能显著改善、Harris评分显著提高等。股骨头供血动脉造影检查可见供血动脉较移植前明显增多、增粗，血流速度增快。

4．间充质干细胞或复合支架移植治疗软骨损伤结果移植术6周后，缺损骨表面可见白色的软骨组织和透明软骨的组织。术后12周，缺损由类透明软骨或透明软骨修复，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，甲苯胺蓝异染性明显，缺损面逐渐变得平整光滑。术后24周，缺损部位形成与周围相同的软骨组织。

【注意要点】

1．严格把握适应证间充质干细胞适于I-Ⅲ期股骨头坏死的治疗。

2．移植细胞数量对治疗效果有很大的影响，移植的细胞数量越多，疗效越好。

3．临床研究结果显示接受干细胞治疗越早，治疗效果越好。