帕金森病（Parkinson's disease, PD）及中枢神经损伤是常见病。其中帕金森病是黑质和黑质纹状体变性所致，主要病理变化是脑黑质致密区多巴胺能神经元变性、数目减少、胞质内出现嗜酸性包涵体等，致使多巴胺合成减少，导致静止性震颤、肌强直、运动迟缓、表情减少等症状的出现。中枢神经损伤常由脑血管出血、梗死或外伤而造成，中枢神经损伤可导致相应的神经功能障碍，可出现失语、偏瘫、持续性昏迷状态等症状，损伤的神经功能难以自我修复，多遗留严重的后遗症。间充质干细胞移植后，可在脑组织微环境中分化成神经元，并与原有组织整合，从而达到治疗的目的。

【材料】

1．组织来源自体骨髓、外周血、脂肪组织、脐带血与脐带。

2．神经细胞定向分化培养用试剂生理盐水，维A酸，碱性成纤维细胞生长因子，肝素。

3．培养基配方和制备无血清培养基。

4．实验器材 二氧化碳培养箱，电动移液器，一次性刻度吸管，50ml离心管、15 ml离心管，骨髓穿刺针或多功能细胞单采仪，低温离心机，培养瓶。

【方法】

1．取材采集自体骨髓、外周血、脂肪组织或脐带血与脐带。

2．间充质干细胞分离骨髓血（同外周血、脐带血）或脂肪组织。

3．神经细胞定向分化诱导培养采用无血清培养基（可含10％供体灭活血浆）将细胞调成悬液，按2×10⁵/cm²接种于培养瓶，置37℃,5% C0₂孵箱中培养3天，吸弃非贴壁细胞，加入新鲜培养基继续培养，每3天换液1次，待细胞覆盖瓶底85％～90％时，常规方法消化并传代。传代3代后，吸净培养液，加入含0.5 ug/ml维A酸、lOng/ml的bFGF的无血清培养基，37℃,5% C0₂条件下培养。每3天换液1次，继续培养2周。取5 ml培养上清液作检菌实验，然后用胰蛋白酶消化细胞，细胞悬液1800r/min离心5分钟，弃上清液，加入生理盐水混匀，1800r/min离心5分钟，重复2次。细胞计数、用生理盐水调成一定浓度用于移植。

4．细胞表现特征间充质干细胞分化为神经细胞后表达巢蛋白（nestin )、神经元特异性烯醇化酶( neuron specific enolase, NSE）及胶质化纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP)。

5．间充质干细胞或神经细胞的应用适合帕金森病、脑炎后遗症、脑发育不良、多发性脑梗死等病变较为广泛的神经功能疾病的治疗。

(1)局部注射：包括立体定位脑内注射和脊髓局部注射；

(2)经脑脊液途径移植：包括腰椎穿刺蛛网膜下腔注射和脑室穿刺注射，其中，腰椎穿刺蛛网膜下腔注射是目前采用较多的间充质干细胞或神经细胞移植方法。即在腰椎3～5椎间隙置入穿刺针达到蛛网膜下腔，注入干细胞或神经细胞，移植细胞随脑脊液的循环遍布大脑和脊髓等部位；

（3）血液循环途径移植。

【结果】

1．间充质干细胞向神经细胞定向分化培养结果诱导培养24小时间充质干细胞开始贴壁生长，贴壁细胞呈梭形；培养3～4天可见细胞呈集落生长，细胞呈放射状向外分布，细胞呈梭形或多角形。维A酸作用后30小时后，细胞胞质向核周收缩，细胞呈双极或多极状，胞体变小，胞浆变少，核质比例增大，细胞核染色加深。继续培养可见细胞长出许多细长突触，细胞间或自身细胞突触互相连接、交织成网。

2．间充质干细胞移植治疗帕金森病的结果间充质干细胞移植治疗帕金森病主要通过：①间充质干细胞渗透到病变组织分化为多巴胺能神经元，替代损伤细胞，重建神经环路，从而达到恢复神经功能的目的；②间充质干细胞分泌多巴胺能神经元营养因子，营养因子促进了损伤脑组织的修复而改善神经功能；③间充质干细胞能够促进内源性多巴胺能神经元的分裂增殖，促进多巴胺能神经元的更新。干细胞移植后分别采用改良的Ashworth分级法、Barthel指数（表12-4)及ADL评分对肌张力与日常生活及活动能力进行评定。干细胞移植3个月后ADL评分增加，生活质量明显提高，Webster评分和肌张力等均较治疗前有明显改善。

Ashworth分级标准：

0级：为正常肌张力；

1级：为肌张力略微增加，受累部分被动屈伸时，在关节活动范围之末呈现最小的阻力，或出现突然卡住和突然释放；1+级：肌张力轻度增加，在关节活动后50％范围内出现突然卡住，然后在关节活动范围后50％均呈现最小阻力；

2级：肌张力明显增加，关节活动范围大时，肌张力明显增加，但受累部分仍能容易地被移动；

3级：为肌张力严重增加，被动活动困难；

4级：为僵直，受累部分被动屈伸时呈现僵直状态，不能活动。

3．间充质干细胞或神经细胞移植治疗中枢神经系统损伤的结果脑疾病或损伤时脑细胞失去正常的冲动传入，会导致释放一些刺激轴突生长的因子，导致干细胞或神经细胞可向损伤部位迁移，促进干细胞分化为神经细胞，并促进突触生长和与宿主神经细胞建立连接，能够促进损伤神经组织的修复和功能的恢复。多数患者在干细胞移植后2～6个月，语言、肌肉、自主神经功能有不同程度的恢复，患者的生活质量有不同程度的提高。

【注意要点】

1．干细胞移植治疗帕金森病的效果，关键在于所移植干细胞的存活、多巴胺的释放以及与纹状体内细胞建立新的连接等。一般来讲，神经细胞在没有形成广泛的突触联系的非成熟状态下移植更易于在宿主的脑内存活与生长。

2．移植细胞与宿主脑细胞建立连接与宿主的年龄相关，宿主越年轻，移植细胞越容易与宿主脑细胞建立连接。

3．每种移植方式各有优缺点，要根据患者的身体状况与病情，选择适合的移植方式。

(1)立体定位脑内注射移植的优缺点：适合于病灶比较局限的疾病和具有集中神经功能核团支配的神经功能退行性疾病，如脑出血后遗症、脑外伤后遗症、局灶性脑梗死、帕金森症及阿尔茨海默病等。此方法优点是可以把干细胞移植到病灶部位，神经功能改善迅速；而缺点是将干细胞直接注射于脑损伤区，移植细胞存活率较低，植入的干细胞易于被激活的小胶质细胞和巨噬细胞所清除。另外，干细胞过度聚集，不利于向神经细胞分化。

(2）脊髓局部移植的优缺点：脊髓局部移植主要是在脊髓损伤的节段进行手术，在受伤脊髓节段上下两端注射干细胞。该方法的优点是移植的细胞分布在损伤脊髓两端发挥作用，同时手术可以起到减压的作用，促进部分脊髓功能的恢复；但缺点是创伤大，存在出血的风险，此外手术本身对脊髓是一次新的损伤，有可能加重神经功能的缺失。

(3)经脑脊液途径移植的优缺点：经脑脊液途径移植包括腰椎穿刺蛛网膜下腔注射和脑室穿刺注射移植。①腰椎穿刺蛛网膜下腔注射的创伤很小，操作简单；缺点是移植的干细胞被分散到整个大脑和脊髓，治疗效果没有定向脑内注射明确，细胞损失较多；②脑室穿刺注射移植：侧脑室穿刺针注射干细胞，干细胞可以直接到达脑室系统，循环至整个神经系统，移植点位于高位，路径较短，干细胞损失较少；缺点在干细胞要经过脑脊液循环到达病灶区，需要移植的细胞数量要增加，穿刺时有出血的风险。

(4）血液循环途径移植的优缺点：血液循环途径移植是使用静脉穿刺的方法，将神经干细胞注入血液循环，干细胞通过血液循环到达神经系统，透过血一脑脊液屏障到达脑组织发挥作用；其弊端在于，从外周静脉进入脑内需经过较长时间的迁移，最后进入脑内的细胞数量十分有限，从而影响治疗效果。