丙二醛(malondialdehyde, MDA）是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激（oxidative stress）时，会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。

针对MDA的水平检测，以硫代巴比妥酸（TBA）方法测得的MDA水平已被广泛用作诊断组织伤害和脂过氧化程度的指标。但TBA方法对MDA的特异性很有争议，MDA只是氧化伤害和脂质过氧化产生的诸多不饱和醛酮产物中主要产物的一种。而硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）则涵盖了大部分氧化伤害产生的醛酮类物质，因而TBARS可被用作为衡量脂质过氧化一个更好的指标。

【材料】

1. 24孔培养板所培养的待测细胞和对照组细胞。

2. TBA-TCA-HCI溶液。用0.125M的HCl配成16.8％的三氯醋酸（TCA)，即TCA-HC1溶液。然后将41.6mg的TBA溶于l0ml的TCA-HCI溶液中，即得到TBA-TCA-HCI溶液。

3. 95℃水浴箱（或普通铝锅开盖煮沸）。

4．可见分光光度计。

5．离心机。

【方法】

1．取出培养板，用细胞刮将细胞刮下来，连同培养液用超声或者反复冻融将细胞破碎。

2．将破碎的细胞混匀，然后取出0.3 ml，加入2ml TBA-TCA-HCI溶液中。

3．将混合后的溶液在80℃的水中水浴15分钟，然后以3000r/min离心10分钟。

4．取上清液在可见分光光度计535nm处比色。

【结果与分析】

细胞受到氧化性损伤时，MDA生成量增多，借此可反映受试物或毒物对细胞损伤的程度。细胞脂质过氧化生成产物的相对含量越高，细胞毒性越低；细胞脂质过氧化生成产物越低，表明细胞毒性越高。

【注意事项】

1．可溶性糖（例如250mM蔗糖）对反应有干扰，可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm )。如果可溶性糖对测定有干扰，可以通过测定450nm作为参考波长进行双波长测定，消除其干扰。

2．如果吸光度值太低，可将几个复孔的细胞合在一起进行测定，或改为更大的培养器皿培养细胞；也可半定量测定，即取细胞裂解液0.15ml，加1 ml的TBA-TCA-HCI溶液。

十二、生物大分子合成状态的检测

【原理】

细胞合成蛋白质时，需要摄取外源性氨基酸。比色法可以测定在任何一个时间点的总蛋白质量。用核素标记的氨基酸如［³H］一亮氨酸或［35s］-甲硫氨酸可以掺入到细胞合成的蛋白质中，通过测定细胞的放射性强度，可以了解细胞蛋白质合成代谢状况。

【材料】

1. 24孔培养板。

2. 1.85x10⁹Bq/ml的[³H]-亮氨酸 用无血清培养液配制。

3. 0.3 mol/L NaOH。

4. 10％三氯醋酸（TCA)。

5．闪烁液与液闪瓶。

【方法】

1．取对数生长期的细胞，悬浮于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，调整细胞密度至10⁴～10⁶/ml，接种到24孔板，每孔加入lml。

2．将细胞移入C0₂孵箱，培养细胞到所需的浓度。

3．取出培养板，加入溶于培养基或BSS中的预热的放射性核素，稀释度为1:10。

4．尽快将培养板放回孵箱，继续培养4～24小时。不同的蛋白质合成速率不尽相同，需预先摸索掺入的时间。当首次测定细胞系蛋白质合成时，要核实合成率在所选的孵育时间内是否为线性关系。

5．取出培养板，小心地从孔中吸去培养基至废弃放射性液体容器中。

6．用冷HBSS或PBSA清洗细胞。某些单层细胞培养，特别是一些松散的连续细胞系，宜先用甲醇(MeOH）固定10分钟。

7．将培养板放到冰上，然后加入0.6mo1/L的TCA，在4℃静置10分钟，吸去上清液。

8．用McOH清洗培养物，然后晾干。

9．每孔加入0.5ml 0.3mo1/L NaOH，在室温中放置30分钟，混匀后移入闪烁瓶中，加入5 ml的闪烁液，用液体闪烁计数仪，测定每分钟的脉冲数（cpm)，以cpm/10⁶蛋白表示。对于悬浮生长的细胞应该采取离心法的处理。

【结果与分析】

计算细胞蛋白质相对合成率（％），见公式13-14。

蛋白质相对合成率越高，细胞毒性越小；蛋白质相对合成率越低，则细胞毒性越大。

【注意事项】

本实验是放射性试验，应该严格执行放射性核素实验操作规程，谨防放射性污染。