三磷腺苷(ATP)仅存在于活细胞之中，是活细胞的最基本能量单位。细胞死亡之后，ATP活性也随之消失。由于ATP水平与活细胞数呈正相关线性关系。用荧光素一荧光素酶试验定量测定细胞内源性ATP的含量，荧光酶在有氧条件下，可以和底物结合后催化ATP转变成ADP，并且释放出荧光（波长562nm)。通过测定内源性ATP的含量所产生的荧光强度，直接反映出细胞的数量。

【材料】

1. 24孔培养板。

2. 0.25%胰蛋白酶。

3. 2％三氯醋酸（TCA)。

4. 0.1 M的Tris缓冲液（pH 9.0)。

5．荧光色素一荧光色素酶试剂。

6．生物发光仪。

【实验步骤】

1．取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化分散成细胞悬液。调成细胞密度为2x10⁵/ml。然后在24孔板中每孔加入l ml的细胞悬液。

2．将培养板在37℃,5％二氧化碳的条件下培养5～7天。

3．吸去培养液，用无血清培养基清洗后，每孔加入2% TCA lml，并用吸管轻轻吹打细胞，使细胞分散。

4．吸取100ul ATP抽提液，加入到l ml试管中，再加入等量的Tris缓冲液，使pH到达7.8。

5．吸取20ul中和的ATP样品，加入0.5 ml的试管中，将试管放在生物发光仪的样品槽中，立即加入荧光色素一荧光色素酶试剂，反应5秒钟后，即可测量ATP样品的发光强度。

【结果与分析】

以ATP相对含量为横坐标，发光强度为纵坐标，绘制标准曲线。参照标准曲线即可算出细胞的存活数量。
细胞的内源性ATP的含量越高，说明细胞毒性越小；反之则说明细胞毒性越大。

细胞内还原型谷胱甘肽(GSH）含量测定

【原理】

谷胱甘肽( glutathione, GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氮酸组成的含琉基的三肽物质，广泛分布于机体各种细胞内。GSH具有抗氧化、清除自由基、解毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线危害等功能，是重要的功能因子，在食品、医药中应用非常广泛。

在细胞中，有多种化合物可以影响GSH的含量，而GSH含量的改变是细胞毒性反应的一个重要指标，并且能诱发氧化应激，可能导致细胞凋亡或死亡。将GSH的酶促反应与荧光素酶的发光反应相耦联，通过发光检测即可确定GSH的含量，从而筛选出可以调控细胞、组织或血液中GSH水平的药物或化合物。

【材料】

1．在96孔板培养的待测细胞核对照组细胞。

2. 0.1M PBS(pH 8.0）

配制：磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）170ml

磷酸二氢钠（NaH₂P0₄）34ml

3. DTNB溶液：用0.1 M PBS将DTNB配制成0.1 mmol/L的DTNB使用液。

4. 6.5％的三氯醋酸（TCA）用0.1 M PBS将TCA配制成60.5％的TCA使用液。

5．可见分光光度计。

【方法】

1．取出96孔板培养的细胞，吸去每孔中的培养液。

2．用0.1 M PBS洗涤培养板的各个孔，然后吸出PBS。

3．每孔加入6.5 % TCAO.05 ml，于4℃放置30分钟。

4．每孔加入0.25 ml的DTNB溶液，然后静置10分钟。

5．在可见分光光度计420nm处比色。

【结果与分析】

计算受试组的细胞还原型谷胱甘肽(GSH）的相对含量，见公式13-12。

细胞GSH的相对含量越高，细胞毒性越低，细胞GSH的相对含量越低，则细胞毒性越高。也可计算细胞GSH的绝对含量，但要先绘制GSH的标准曲线，方法类似于蛋白质标准曲线。

【注意事项】

若细胞在24孔培养板培养，可经过超声破碎或者用溶解液溶解，再测量GSH，但是在96孔板上培养的则可直接加入6.5％的TCA提取GSH，然后进行比色。