姐妹染色单体交换（sister chromatid exchange, SCE）是指在细胞周期的S期内的姐妹染色单体相同位点上的DNA片段发生互换，可能与DNA双链的断裂与复制有关，SCE的发生的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的SCE率明显增高，可表明染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。与染色体断裂相比，SCE是一个更加敏感的诱变活性指标，因此已成为研究诱变的一种主要工具。

在细胞分裂时，每条染色体均有两条染色单体组成，每条染色单体有一条双链DNA组成。5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(TdR）的类似物，在DNA链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。当细胞生存环境中存在BrdU时，BrdU可取代脱氧胸苷掺入到复制的DNA中。经两个复制周期后，同一染色体的两条姐妹染色单体在化学组成上出现差别，其中一条DNA的双链均有BrdU掺入，而另一条DNA双链中仅有一条链有BrdU掺入，而这种双股含有BrdU的DNA链具有螺旋化程度较低的特性，可降低其对某些染色剂的亲和力，利用特殊的分化染色技术对染色体标本进行处理，可使双链均含有BrdU掺入的单体浅染，而只有一条链掺入BrdU的单体深染。当姊妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的DNA序列相同，SCE并不改变遗传物质组成，但SCE是由于染色体发生断裂和重接而产生的，因此，SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率，用来研究药物和环境因素的致畸效应。

【材料】

1．超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、冰箱、离心机、显微镜、培养瓶、刻度离心管、胶塞、乳头吸管、载玻片、托盘天平、干燥烤箱、染色缸、30W紫外灯。

2．细胞培养液含20％新生牛血清的RPMI 1640培养液，按常规量加入抗生素，用NaHC0₃调pH7.2～7.4。

3. 1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH6.8）称取磷酸二氢钾（KH₂P0₄) 4.50g和磷酸氢二钠（Na₂HP0₄·12H₂0)11.81g，加蒸馏水至l000ml。

4. PE10mmol/L EDTA（溶于PBS)。

5. 2x柠檬酸缓冲液（SSC）称取NaCl 17.53g,枸橼酸三钠8.82g溶于1000ml蒸馏水中。

6．低张缓冲液。0.075mo1/L KCI。

7．固定液甲醇(3);醋酸（1)，置于冰上，新鲜配制。

8. BrdU贮存液用无菌纯水制备1 mmol/L的贮存液，避光，冰箱保存（或用时现配）。

9．吉姆萨染液取吉姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加125 ml甘油，放入37℃温箱中保温48小时。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤,2周后使用，作为吉姆萨染液原液。使用时，取1份吉姆萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8)混合。

10．秋水仙素10ug/ ml。

11. Hoechst 33258用磷酸盐缓冲液配制，20 ug/ml。

【方法】

1．将受试物分为三个浓度组。以有细胞毒作用的浓度100mmo1/L或5mg/ml为最高剂量组，中、低剂量组可为10倍间隔。不溶性受试物在上述剂量范围内可能有沉淀出现。阳性对照用甲基磺酸乙酯(EMS)0.30ul/ml，阴性对照用溶剂。

2．以1x10⁶密度接种贴壁细胞，于37℃,5% C0₂条件下培养2天，加入受试物作用1～2小时。

3．将10umol/L的BrdU应用液加入细胞培养基中，继续37℃,5% C0₂条件下培养48小时（约2个细胞周期）。

4．根据细胞周期时间的不同，在收获前2小时加入终浓度为0.01 ug/ml秋水仙素。

5．用PBS清洗细胞，用PE配制的胰蛋白酶消化细胞，用5 ml培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至20ml离心管中，1500r/min离心5分钟。

6．小心吸去上清液，留下约0.5 ml沉淀物，轻弹管壁，重悬沉淀，缓慢加入5 ml经预热(37℃）的低渗缓冲液，吹打均匀后室温孵育15～30分钟。

离心（1500r/min,10分钟）后，弃上清液，留下沉淀物0.5 ml，轻弹管壁，重悬沉淀。

7．加入6ml冰冷的固定液，最初逐滴加入，每加一滴都要充分混匀，冰上放置10分钟。

8．重复步骤（5)和（6)1～3次，将细胞留在固定液中4℃过夜。

9．将固定的细胞于2000r/min离心5分钟，用3ml甲醇／醋酸重悬细胞后，储存于-20℃温度下。

10．将预冷的载玻片用无水乙醇擦拭，以保证洁净，没有油脂。

11．取1～2滴细胞悬液滴至玻片上，避光，在空气中晾干载玻片。

12．在相差显微镜下检查载玻片，确保载玻片上中期细胞分布均匀，并且染色体分散良好。

13．将载玻片浸入盛有Hoechst 33258的玻片染色缸中，放置10～15分钟。

14．在玻片上滴500ul 2x柠檬酸缓冲液（SSC)，盖上盖玻片，用暂时性封蜡封上。

15．用30W紫外线灯距标本6cm垂直照射30分钟。

16．将盖玻片移开，用蒸馏水清洗载玻片3次，每次5分钟，避光，空气中晾干载玻片。

17．将载玻片放入盛有Giemsa染色液（pH6.8)的染缸中，染色8～10分钟，用自来水小心冲洗漂洗载玻片，用吸水纸吸去水分。

18．将载玻片晾干后，加盖玻片。

19．在40x物镜的光学显微镜下筛选出有中期分散染色体的载玻片。

20．在载玻片上找出中期分散染色体分布最多的区域，在油镜下观察计数SCE 。选择染色体展开良好，染色深浅分明，染色体数目正常的中期相，每一剂量组至少观察50个中期相细胞，计数每个细胞染色单体中染色深浅交换次数，凡交换发生在染色单体端部或者丝点部位计为一次SCE，交换发生在染色单体中间计为两次SCE。如图13-2箭头所示。

21．姐妹染色单体交换分数按每个细胞内的姐妹染色单体交换的平均数目与每个细胞内的染色体平均数目的比值计算。

【结果与分析】

至少有一个剂量SCE频率超过溶剂对照组的2倍，并有剂量反应关系或可重复出现，即为强阳性;3个剂量的SCE均超过正常值，且其中一个剂量SCE频率与溶剂对照组比较有统计学意义（P<0.05）并有剂量反应关系，可判为弱阳性，需重复验证。

【注意事项】

l. SCE的基线频率受细胞类型、培养条件、细胞收获时间、染色方法和SCE计数等多因素的影响，各实验室的报道差别较大，所以应该建立自己实验室的基线频率，从而提高结果判断的可靠性。

2. BrdU应4℃避光保存，或临用时现配。其浓度不宜太高，以免产生细胞毒性。

3．严格控制pH，以利于细胞生长。

4．分化染色时，紫外灯照射距离及水浴箱温度要控制好，否则影响分化效果。

5. Hoechst 33258具有强致癌性，要在通风橱中称量与溶解。