一、实验目的

    掌握高效液相色谱法测定鸡蛋中呋喃丹残留量的原理与方法。

    二、实验原理

    样品经提取、净化、浓缩、定容、微孔滤膜过滤后，采用反相高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    高效液相色谱仪(附紫外检测器)、旋转蒸发仪、振荡器。

    2．试剂

    除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)常规试剂与溶液：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、环己烷、NaCl、CH₂Cl₂、无水Na₂SO₄(120℃干燥4h)、Bio-Beads S-X₃凝胶(200～400目)、乙酸乙酯一环己烷混合液(1+1，体积比)。

    (2)呋喃丹标准品溶液：称取一定量的呋喃丹标准品(纯度大于99％)，用甲醇配制成一定浓度的标准储备液，置于4℃保存，使用前用甲醇稀释成5.0μg／mL的使用液。

    3．实验材料

    2～3种新鲜鸡蛋，各200g。

    四、实验步骤

    1．样品提取    

    (1)称取经去壳、匀浆的鸡蛋液20.00g，置于100mL具塞锥形瓶中，加水5mL左右(控制总水量约20g。通常鲜蛋的水分含量约75％，所以加水5mL即可)。

    (2)加40mL丙酮，振摇30min，加NaCl l6g，充分摇匀溶解后，再加30mL CH2Cl2，振摇30min后，静置。

    (3)取35mL上清液，经无水Na2SO4滤于旋转蒸发瓶中，于40℃浓缩至约1 mL。

    (4)加2mL乙酸乙酯一环己烷混合液，摇匀后再浓缩，如此重复3次，最后浓缩至约1mL。

    2．样品净化

    (1)取长50cm、内径2.5cm的带活塞玻璃色谱柱一根，柱底垫少量玻璃棉，将乙酸乙酯环己烷混合液提泡过夜的凝胶以湿法装入柱中，柱床高约40cm。注意确保柱床始终保持在混合液中。

    (2)将提取浓缩液经凝胶柱，以乙酸乙酯一环己烷混合液洗脱，弃去0～35mL流分，收集35～70mL流分。

    (3)将收集到的流分，于40℃旋转蒸发浓缩至约1mI。，再过凝胶柱净化，以乙酸乙酯一环己烷混合液洗脱，收集35～70mL流分，旋转蒸发浓缩至约2mL后，以氮气吹至约1mL，以乙酸乙酯定容至1mL，备用。

    3．测定

    (1)分别将5μL标准品溶液及试样净化液注入色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰高或峰面积与标准比较定量。

    (2)参考色谱条件：色谱柱为Altima C18柱(4.6mm×25 cm)；流动相为甲醇一水(60+40，体积比)，流速为0.5mL／min；柱温为30℃；紫外检测波长为210nm。

    4．计算

    按下式计算样品中呋喃丹的含量：

    x=mV₂/m₀V₁

    式中，x为样品中呋喃丹的含量，mg／kg；m为被测样液中呋喃丹的质量，ng；m₀为样品的质量，g；V₁为试样液的进样体积，μL；V₂为试样最后的定容体积，mL。

    五、注意事项

    1．实验步骤中的色谱条件仅供参考，具体的分析条件应该根据所用气相色谱仪的型号，参考说明书中的条件进行。

    2．实验中NaCl的用量可根据试样含水量的多少调整，确保提取液盐析过程处于过饱和状态。

    3．盐析过程要充分，无水Na2SO4的量要足够，确保上清液中无水，否则影响净化效果。

    六、思考题

    1．本方法是否适用于鸡蛋以外其他动物性食品中呋喃丹残留的检测?为什么?

    2．简述凝胶柱净化的原理。

    3．为什么在样品提取过程中最后要加以乙酸乙酯一环己烷混合液溶解浓缩3次?