一、实验目的

    掌握蜂蜜中氯霉素残留的直接竞争EL[SA检测的原理和方法。

    二、实验原理

    直接竞争ELISA是ELISA的一种。样品中残留的氯霉素与氯霉素酶标记物共同竞争包被于

酶标板微孔内的氯霉素抗体，形成的酶标记抗原抗体复合物被吸附于微孔内，加底物显色后，于450nm处测定吸光度，吸光度大小与样品中氯霉素的残留量成反比。以标准品为对照，根据吸光度计算出样品中氯霉素的残留量。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材

    酶标仪、各种规格的移液器、离心机、氮气吹干仪、液体混匀器、振荡器等。

    2．试剂

    除特别注明外，实验中所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。

    (1)ELISA试剂盒：包含包被有抗氯霉素抗体的96孔酶标板、氯霉素标准溶液、氯霉素酶

标记物溶液、酶底物、发色剂、反应终止液、缓冲溶液等。

    (2)试剂：乙酸乙酯(重蒸馏)。

    3．实验材料

    2～3种蜂蜜，各1()00g。

    四、实验步骤

    1．样品的预处理

    对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超过60℃的水浴中加热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。取500g作为实验样品。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识，于室温下保存。

    2．样品提取    

    取2．00g样品，置于25mL具塞离心管中，加4mL水和4mL乙酸乙酯，于液体混匀器上充分混匀2min，使试样完全溶解。在振荡器上振荡10min，以4000r／min离心10min。吸取上层乙酸乙酯1mL于10mL具塞试管中，用氮气吹干仪在50℃吹干。加O．5mL缓冲溶液溶解残渣，得样品提取液。

    3．测定

    (1)标准曲线的绘制

    ①分别吸取50μL系列稀释的氯霉素标准溶液与适当稀释的酶标记氯霉素，加入酶标板微孔

内，重复数为3，混匀后，于37℃避光保温1h。以稀释缓冲溶液洗酶标板5次，每次3min，扣干。

    ②加50μL酶底物与50μL发色剂于微孔内，混匀，于37℃避光保温30min。

    ③迅速加100μL反应终止液于微孔内，混匀后，于450nm处测吸光度。

    ④以氯霉素浓度的对数为横坐标，不同浓度氯霉素微孔吸光度与氯霉素浓度为零的微孔的

吸光度的比值的百分数为纵坐标，绘制标准曲线。

    (2)样品测定

    将50μL样品提取液替代氯霉素标准溶液加入微孔内，其他操作同“标准曲线的绘制，，中的①～③。根据吸光度与氯霉素浓度为零的微孑L的吸光度的比值从标准曲线上查出样品提取液中氯霉素的含量。

    4．计算

    x=cV/m

    式中，x为样品中氯霉素的残留量，μg／kg；c为样品提取液中氯霉素的浓度，ng／mL；V为样品提取液的定容体积，mL；m为样品提取液所代表的样品质量，g。

    五、注意事项

    实验步骤中的实验操作参数仅供参考，具体的操作条件与过程应严格按照实验中所使用的试剂盒的说明进行。

    六、思考题

    1．简述ELISA的分类。

    2．与仪器分析方法相比，以ELISA检测样品中氯霉素的含量有哪些优点?