一、实验目的

    掌握直接竞争EuSA测定鸡肉中磺胺喻啶(sulfadiazine，SD)残留量的原理和方法。

    二、实验原理

    直接竞争酶联免疫吸附(direct competitive erlzyme linked immunosorbent assay)是ELISA中的一种。首先将抗磺胺嘧啶特异性抗体吸附(固定)于酶标板微孔内，然后同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争微孔内固定的抗体结合位点，保温沈涤后，加底物显色，颜色深浅与待测抗原的量成反比。

    三、仪器与试材

    1．仪器与器材    

    酶联免疫检测仪、匀浆机、高速离心机、移液器等。

    2．试剂    

    (1)常规试剂：乙腈、乙酸乙酯、NaHC03、Na2CO3、KH2P04、Na2HPO4、NaCl、KCl、H2SO4等。

    (2)标准品与ELISA试剂：磺胺嘧啶标准品(纯度≥99％)、兔抗磺胺嘧啶抗体、酶标抗原

(SD—HRP，辣根过氧化物酶标记的磺胺嘧啶)、吐温-20、显色剂TMB(四甲基联苯胺)、过氧化

氢脲、脱脂奶粉。

    (3)常规溶液：86％乙腈溶液、磷酸盐缓冲液生理盐水(pH=7.2，0.1mol／L，简称PBS)、

pH=9.5的O.1mol／L碳酸盐缓冲液(ELISA包被液，简称CBS)、5％的脱脂牛奶(溶于ELISA洗涤液)、pH=5.O的0.1mol／L柠檬酸-O．2mol／L Na2HP04缓冲液(底物缓冲溶液)、2mol／LH2SO4溶液(终止液)。    

    (4)ELISA洗涤液(PBST)：将Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2P04 O.2g、NaCl 8.Og、KCl O.2g、Tween-20 0．5mL溶于1000mL蒸馏水中。

    3．实验材料

    2～3种鸡肉，各250g。

    四、实验步骤

    1．样品提取

    (1)取50g剔除皮与筋骨的鸡肉，切碎后，于组织匀浆机中搅碎。

    (2)取5．00g匀浆样品，加20mL乙腈溶液，振摇10min，以3000r／min离心10min。

    (3)取上清液3mL与3mL水混合后，再加4．5mL乙酸乙酯抽提10min，以3000r／min离心1Omin。  

    (4)上层乙酸乙酯提取液吹干后，加1．5mL PBS溶解，备用。

    2．标准曲线的绘制

    (1)包被：在96孔酶标板的微孔内，每孔加100μL溶于CBS中的抗磺胺嘧啶抗体(浓度为1ng／mL)，于4℃过夜。取出酶标板，恢复至室温，倾去包被液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。

    (2)封阻：每孔加200μL 5％的脱脂牛奶(溶于PBST)作为封阻液，于37℃保温保湿2h。取出酶标板，倾去封阻液，用PBST满孔洗涤3次，每次5min，扣干。

    (3)抗原抗体竞争反应：每孔加入以PBST适当稀释的酶标磺胺嘧啶：50μL，同时分别加入不同浓度的磺胺嘧啶标准溶液50#L，使添加标准溶液的微孔中磺胺嘧啶的终浓度分别为O、0.1ng／mL、0．3ng／mL、0．9ng／mL、2．7ng／mL和8．1ng／mL。混匀，每个浓度做3个平行。于37℃保温保湿1h后，以PBST满孔洗涤3次，扣干。

(4)显色：每孔加入显色剂TMB和过氧化氢脲各50μL，于室温条件下避光反应15min。

    (5)测定：每孔加入40μL 2mol／L的H2SO4溶液终止反应，5min后，以空白孔调零，在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度。

    (6)标准曲线的绘制：以磺胺嘧啶浓度的对数为横坐标，竞争抑制率(各微孔吸光度与磺胺嘧啶浓度为O的微孔的吸光度的比值的百分数)为纵坐标，绘制标准曲线。

    3．样品测定

    (1)除了在“标准曲线的绘制”中(3)所述的抗原抗体竞争反应中，以50μL样品提取液

替代磺胺嘧啶标准溶液外，其他操作过程同“标准曲线的绘制”中(1)～(5)。

    (2)根据样品提取液的竞争抑制率，从标准曲线上查找并计算样品提取液中磺胺嘧啶的

浓度。

    4．计算

    按下式计算样品中磺胺嘧啶的含量：

    x=c×(V1/V2)×(1/m)

    式中，x为样品中磺胺嘧啶的残留含量，μg／kg；c为样品提取液中磺胺嘧啶的质量，ng；

V1为样品提取液的体积，mL；V2为测定用提取液的体积，mL；m为样品的质量，g。

    五、注意事项

    1．在ELISA中，洗涤足决定实验成败的关键步骤之一。因为在ELISA过程中，除了抗原抗

体的特异性结合外，还存在多种非特异性吸附，洗涤可以消除这些非特异性吸附，从而避免假阳性结果的出现，所以洗涤一定要按照要求进行，不得随意减少洗涤的次数。

    2．在底物显色过程中，温度和时间是主要影响因素。通常情况下，在一定时间和温度下，阴性对照孔(不加抗原和酶标抗原的孔)可保持无色，而阳性对照孔(标准品浓度为0的孔)则随时间的延长而呈色加强。但是，如果时间过长或温度过高，阴性对照孔也可能产生颜色，从而影响分析结果。因此，应根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延长显色时间。

    3．ELISA检测操作过程复杂，影响因素较多，为了确保实验的准确性，样品的测定条件必

须与标准曲线的绘制条件保持一致，最好在同一酶标板内完成。

    六、思考题

    1．简述直接竞争ELISA的原理。

    2．在ELISA中，如何确定抗原抗体反应的最适浓度?