一、实验目的

掌握酱油中菌落总数的测定方法。

二、实验原理

酱油样品经过稀释后，采用混菌法与平板计数琼脂培养基混匀制备平板，待琼脂凝固后，将平板置于(36±1)℃培养(48±2)h后，计数。

三、仪器与试材

1．仪器与器材

超净工作台、生化培养箱、天平、振荡器、pH计、放大镜、培养皿(90mm)、吸管、锥形瓶、试管等。

2．培养基与试剂

平板计数琼脂(PCA)培养基、无菌生理盐水。

3．实验材料

3～4种不同品牌与包装的酱油，各100mL。

四、实验步骤

1．检验流程

2．样品稀释

(1)以无菌操作分别取25mL混合均匀的酱油样品，放于盛有225mL无菌生理盐水的500mL锥形瓶内(瓶内预置适量的玻璃珠)，充分振荡，制成1：10的稀释液。

(2)用1mL无菌吸管吸取1：10的样品稀释液1mL，沿试管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇昆匀，制成1：100的稀释液。

(3)另外，取lmL无菌吸管，按相同操作，制成1：1000的稀释液。

(4)如此10倍递增稀释至1：10000的样品稀释液。每递增稀释一次必须换一支无菌吸管。

3．制平板

(1)根据GB2717--2003的规定，酱油中菌落总数应小于等于30000cfu／mL，所以选择10～10“三个稀释度的样品稀释液lmL于无菌平皿中(可以在制作稀释液的同时进行)，每个稀释度做2个平皿。

(2)将冷却至45～50℃的平板计数琼脂培养基(约15mL)注入上述含有稀释液的平皿中，转动平皿，混合均匀后，制成平板。同时，将平板计数琼脂培养基倾人含lmL无菌生理盐水的两个无菌平I【lL中，作空白对照。

4．培养

待琼脂凝固后，翻转平板，置(36±1)℃培养(48±2)h。

5．计数

(1)平皿菌落计数时，直接以肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。菌落计数以菌落形成单位(colonyformingunits，cfu)表示。

(2)选取菌落数在30~300cfu之间的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落

数，大于300cfu的可记录为“多不可计”(toonumeroustoeount，TNTC)。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

6．结果表述．

(1)若只有一个稀释度的菌落总数在30～300cfu之间，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每克(或毫升)中菌落总数结果。

(2)若所有稀释度的平均菌落数均大于300cft，，则取稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算，其他平板可记录为“多不可计”。

(3)若所有稀释度的平均菌落数均小于30cfu，则以稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数计算。

(4)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300cfu之间，有的大于300cfcI，有的小于30cfu一

时，则应以最接近300cfu或30cfu，的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

五、注意事项

1．整个实验过程中，必须严格按无菌操作进行。

2．每递增稀释一次必须换一支无菌吸管，否则将严重影响实验结果。

3．本方法也适合于除酱油外的其他液体食品样品和固体食品样品，但是对于固体食品样品在加入稀释液后，最好置无菌均质器中以8000～1000r／min的速率处理1min，配制成1：10的均匀稀释液。

4．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。

5．在选择平板计数时，’如果菌落生长成片状，且片状菌落大于平板的一半，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可以计算半个平板后乘以2以代表整个平板的菌落数。