一.肉毒梭菌

肉毒梭菌（C.botulinuw）主要存在于土壤中，是一种腐生菌，能产生毒性极强的外毒素，引起人和动物严重的肉毒中毒和婴儿肉毒病。

（一）生物学特性

1．形态结构肉毒梭菌是革兰阳性粗大杆菌，大小为(0.9～1.3)um×(4.0～6.0)um，两端钝圆，单个、成双或短链状排列。有周鞭毛，无荚膜，芽胞呈椭圆形位于菌体的次极端，芽胞直径大于菌体，使菌体呈汤匙状或网球拍状。

2.培养特性严格厌氧，营养要求不高，可在普通琼脂平板上生长，35℃培养48 h后，形成灰白色、半透明、边缘不整齐、表面粗糙的菌落，在厌氧血琼脂平板上有β溶血。在庖肉培养基中生长旺盛，能消化肉渣使之变黑，有腐败恶臭。在卵黄平板上能产生脂酶，菌落周围出现混浊圈，菌落表面形成一层珠光层。

3．毒素与分型根据所产生毒素的抗原性不同，分为A,B,C1,C2,D,E,F,G 8个型，大多数菌株只产生一种型别的毒素，各型毒素只能被同型抗毒素所中和。引起人类疾病的主要为A型和B型，E型、F型偶见。我国报告的大多数为A型。

4．生化反应因毒素型的不同而有所差异，A型,B型、E型、F型发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，C型,D型发酵葡萄糖、麦芽糖，不发酵蔗糖，各型均不发酵乳糖，G型不发酵糖类。各型均产生硫化氢，不产生吲哚。除G型外均产生脂酶。气液相色谱分析，各型均可产生乙酸和丁酸，其他有机酸则随型别而异。

5．抵抗力肉毒梭菌芽胞的抵抗力较强，可耐100℃煮沸1h以上，但所产生的肉毒毒素不耐热，100℃煮沸1 min或80～90℃煮沸5～10 min即可被破坏。

（二）临床意义

肉毒梭菌主要依靠其产生的毒性极强烈的外毒素（肉毒毒素）引起致病。肉毒毒素对酸和蛋白酶的抵抗力较强，口服后不易被胃、肠消化液破坏。肉毒毒素具有嗜神经性，经胃肠吸收入血，然后作用于中枢神经系统的脑神经核、外周神经-肌肉接头处以及自主神经末梢，阻碍胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，导致肌肉出现弛缓型麻痹。肉毒中毒的临床表现与其他食物中毒不同，胃肠道症状很少见，主要为神经末梢麻痹。潜伏期可短至数小时，一般先有不典型的乏力、头痛等症状，接着出现复视、斜视、眼睑下垂等眼肌麻痹症状；随后出现口干、吞咽和咀嚼困难、口齿不清等咽部肌肉麻痹的症状，进而引起隔肌麻痹、呼吸困难，直至呼吸停止而死亡。很少见肢体麻痹，一般不发热，神智清楚。

成人食入肉毒毒素污染的食物可引起肉毒中毒，食入含有肉毒梭菌芽胞的食物并不引起疾病。1岁以下、特别是6个月以内的婴儿，食入被肉毒梭菌芽胞污染的食品（如蜂蜜等）后，因其肠道的特殊环境及缺乏能拮抗肉毒梭菌的正常菌群，芽胞在肠道内能发芽繁殖，产生的肉毒毒素经肠道吸收而致病，属于感染性中毒，称为婴儿肉毒病。临床表现与成人肉毒毒素食物中毒类似，但症状较轻，最先出现的症状是便秘、吸乳、啼哭无力。婴儿肉毒病死亡率不高(1％～2％)。

若伤口被肉毒梭菌芽胞污染后，芽胞在局部的厌氧环境中能发芽成为繁殖体，生长繁殖、产生毒素，毒素被吸收后也。可导致创伤感染中毒。

（三）微生物学检验

食物引起的肉毒中毒，其诊断主要依靠检出毒素。在检查毒素的同时作细菌分离培养，并检测分离出的细菌是否产生毒素及毒素的型别。

1．检验程序 肉毒梭菌的检验程序见图23-4。

图23-4肉毒梭菌的检验程序

2．标本采集 从患者血清中检出毒素是最直接、最有效的方法，其次是采集患者的粪便、胃液、呕吐物等。采集可疑食品送检，对于判断食品与中毒的关系有重要意义。婴儿肉毒病可取粪便分离病原菌并检测毒素。

3．直接显微镜检查 肉毒梭菌广泛分布于自然界，故标本直接涂片镜检意义不大。

4．分离培养 本菌要获得纯培养较困难，常用增菌方法，促进混合培养物中肉毒梭菌生长和毒素的产生。将标本接种于庖肉培养基中，再经动物接种和保护性试验，以证明毒素的性质。如混合培养物中有肉毒梭菌存在，可接种于厌氧血琼脂平板和卵黄琼脂平板中进行分离培养，厌氧培养36～48 h后，取可疑菌落纯化后作最后鉴定。本菌对氧极为敏感，接种的平板应尽快放入厌氧环境中培养。

5．鉴定肉毒梭菌的主要特征：革兰阳性粗大杆菌，芽胞呈椭圆形位于次极端，大于菌体，使菌体呈汤匙状或网球拍状。在庖肉培养基中能消化肉渣变黑。除G型外，各型均发酵葡萄糖和麦芽糖，不发酵乳糖。产生硫化氢，不产生吲哚。除G型外均产生脂酶。肉毒毒素检测试验阳性。

6．毒素检测可疑食物、呕吐物、胃肠冲洗液、粪便浸液、血清及庖肉培养液等，低速离心取上清液作肉毒毒素检测。检测方法分为定性试验和毒素型别鉴定，定性试验可做小鼠毒力和保护力试验，毒素型别鉴定可用分型血清做中和试验和反向间接血凝试验等。

二、艰难梭菌

艰难梭菌（C.difficile）是人和动物肠道中的寄生菌，在幼儿的粪便中最常见，为肠道正常菌群。由于对氧十分敏感,很难分离培养而得名。

（一）生物学特性

艰难梭菌为革兰阳性粗长杆菌，大小为(1.3～1.6)um×(3.6～6.4)um,培养48 h后革兰染色镜检呈阴性，有的菌株有周鞭毛，芽胞呈卵圆形，位于菌体次极端，无荚膜。

严格专性厌氧，常规厌氧培养法不易生长。在厌氧血琼脂平板、牛心脑浸液琼脂平板上厌氧培养48 h后形成直径3～5 mm、圆形、略凸起、白色或淡黄色、边缘不整齐、表面粗糙不溶血的菌落。在专用的选择性培养基环丝氨酸-头孢甲氧霉素-果糖-卵黄琼脂(CCFA）平板上形成边缘不整齐、表面粗糙或呈毛玻璃样的黄色大菌落，在紫外线照射下可见黄绿色荧光。

能发酵葡萄糖、果糖、甘露醇产酸，不发酵乳糖、蔗糖和麦芽糖，不分解蛋白质，不产生吲哚硫化氢，不产生卵磷脂酶和脂酶。

（二）临床意义

艰难梭菌对氨苄青霉素、头抱霉素、红霉素、克林霉素等耐药，临床长期使用这些抗生素后可引起肠道菌群失调，耐药的艰难梭菌则可大量繁殖并产生毒素而致病。该菌是引起抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎最主要的病原菌之一。

艰难梭菌能产生A,B两种毒素，A毒素为肠毒素，可导致肠液大量分泌；B毒素为细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，直接损伤肠黏膜细胞，造成伪膜性结肠炎。

艰难梭菌也可引起气性坏疽、脑膜炎、菌血症、肾孟肾炎及腹腔感染等，已成为医院感染的重要病原菌之一。

（三）微生物学检验

1．标本采集采集新鲜粪便或直肠拭子，立即送检。

2．直接显微镜检查取标本直接涂片，革兰染色后镜检，镜下若见标本中有大量呈优势生长的革兰阳性粗长杆菌，结合患者有长期大量使用抗生素的病史，可初步报告。

3．分离培养将标本接种于厌氧血琼脂平板、牛心脑浸液琼脂平板和CCFA选择培养基上，35℃厌氧培养48 h后挑取典型菌落，然后转种于庖肉培养基中进行纯培养，用于鉴定试验和毒素测定。

4．鉴定 艰难梭菌的主要特征：革兰阳性粗长杆菌，芽胞呈卵圆形，位于菌体次极端，无荚膜。在CCFA平板上形成表面粗糙的黄色菌落，在紫外线照射下，可见黄绿色荧光。能发酵葡萄糖、果糖，不发酵乳糖，不分解蛋白质，不产生吲哚和硫化氢，不产生卵磷脂酶和脂酶。毒素测定试验阳性。

5．毒素检测 艰难梭菌的毒素测定常用细胞培养法。将粪便浸液和庖肉培养液离心后，取上清液过滤除菌，配制不同的稀释度加入到细胞培养液中，培养24～48 h后观察细胞病变，如单层成纤维细胞肿胀变圆、细胞脱落或破裂即为阳性。此外，还可用胶乳凝聚试验、间接ELISA等方法直接检测毒素。