突变体是遗传分析的基础，无论是经典的遗传学还是现代遗传学对突变的分析都是遗传学永恒的主题。从理论上讲，任何一个野生型都有对应的突变型。但是，由于生物体的进化特点(基因突变后可能产生的致死效应、基因的补偿效应等)或者人为条件的限制等因素使得要在自然界中找到具有一个特定性状的突变体十分困难。因此，为了研究方便，采用人工的方法创造出突变体就十分必要。

创造人工突变体的方法多种多样，主要包括化学诱变、物理诱变和遗传学方法等。化学、物理法人工诱变可以短时间内创造出大量的突变体材料，但是利用化学诱变、物理诱变所导致的突变方向性是随机的，突变位点的染色体周围没有携带标签。因此，虽然利用物理、化学诱变等方法能够创造大量的突变体的材料，但是要从得到的突变体基因组中克隆目的基因仍然需要通过图位克隆的方法进行。相反，利用T-DNA、转座子等方法获得的突变体则完全不同。由于利用T-DNA、转座子等方法获得的突变体突变位点附近含有“分子标签”，这些标签的存在为快速分离目的基因提供了极为有利的条件。因此，我们对以突变体为基础的基因克隆方法进行介绍。

1. T-DNA标签法

T-DNA是存在于植物根癌农杆菌Ti质粒中的一段特殊的DNA序列，当根癌农杆菌感染了寄主植物细胞以后，T-DNA分子在Vir基因的帮助下会从细菌细胞转移到植物细胞中，通过T-DNA两端25bp左右的碱基重复序列，T-DNA随机地整合到植物基因组中。如果T-DNA整合到功能基因的内部或者功能基因的调控区域，这种整合就可能导致功能基因的失活而产生各种不同的突变。利用T-DNA的随机插入特性，理论上只要遗传转化的次数加大就可以获得覆盖全基因组的突变群体。

由于农杆菌的遗传转化在植物中已经十分成熟，转化阳性率比较高(烟草的转化率可以达到30％以上)，并且可以产生大量的可以观察到表型特征的突变个体，因此T-DNA标签法在基因的克隆过程中十分有用。

利用T-DNA插入突变体分离克隆基因的步骤(图8-8)如下所述。

图8-8T-DNA标签法克隆基因的示意图

(1) T-DNA插入突变体的获得：利用农杆菌介导方法将T-DNA插入到目标植株。转化再生的植株通过抗生素的筛选和分子(如PCR, Southern杂交)分析检测T-DNA是否转化到受体植物中。

(2)突变体的鉴定：通过基因的表达方式确定是否引起基因的表达变化，也就是确定基因是否发生变异。如果由于T-DNA插入引起基因突变和表型变异，那么该突变体就可以用于遗传分析。

(3)候选基因的分离：由于T-DNA上具有20bp左右的特殊重复片段，那么就可以以该片段为引物通过反向PCR的方法扩增获得T-DNA插入区间的相连片段。再以该片段为探针对突变体的基因组文库进行筛选就可以分离含有目的基因的克隆。

(4)功能基因的互作鉴定：通过回复突变的手段，可以方便地鉴定分离的基因是否正确。

2．增强子或者外显子陷阱的方法(enhancer-trapping, exon-trapping)

陷阱法的基本原理是通过改变基因转录水平来观察表现型的改变，从而达到分离基因的目的。在高等真核生物中绝大多数基因是间隔基因，既有内含子又有外显子，基因的表达调控与其他调控元件[如增强子(enhancer)]有关，如果外来的增强子插入到基因附近就可能预期附近基因的表达增强，从而获得突变体。

植物陷阱系统最早可以追溯到1986年，当时Teeri等将不带启动子的抗生素标记基因转化到植株中，抗生素标记基因的表达依赖于它能否插入到合适的区域，如植株内的启动子下游或者紧临外显子区。如果抗生素基因插入到上述区域就会导致植株获得抗某种抗生素的性状。随后以β-gus, uidA报告基因作为选择的标记基因。彩图2中表示了几种不同类型的陷阱系统以及它们插入到染色体上可能出现的情况。①无启动子的抗生素基因位于目的基因的下游，抗生素基因在增强子的作用下表达。②无启动子的抗生素基因位于目的基因的内部，与目的基因的外显子相互融合，读码框的方向相同并且不发生改变，抗生素基因在增强子的作用下表达。③将外源抗生素基因替换为报告基因，如①中的情况一样，外源报告基因也能够在植物内源基因的启动子作用下进行表达。④将外源抗生素基因替换为报告基因，如②中的情况一样，外源报告基因也能够在植物内源基因的启动子作用下进行表达。⑤该例子中，转化的外源基因同时包括报告基因和抗生素基因，这种外源载体在转化植株以后可能出现③、④两种情况。

利用陷阱系统，能够方便地检测到外源基因插入区的情况，克隆有关外源基因插入区附近的植物基因组中内源基因的全部序列。陷阱系统克隆基因的思路与T-DNA等插入突变的技术路线非常相似，差别在于前者的前提在于检测报告基因或者抗生素基因表达的变化，而后者的前提在于获得稳定的突变个体(图8-9)。

图8-9用于苜蓿基因组计划的基因陷阱系统载体

陷阱系统的最大缺点是由于T-DNA插入时，往往不只是一个拷贝的基因而可能是多拷贝的基因。这种多拷贝的基因可以是在一个位点上也可以是在多个位点上，在一个位点上的多拷贝又有正向和反向等多种不同的类型。多拷贝T-DNA的插入使人难以分清报告基因的表达来自哪一个区段，除此之外要分离这些不同拷贝插入区的边界序列也比较困难。