一、转化细胞的选择培养和高频再生

(一)转化细胞的选择

选择转化细胞是基因转化重要的步骤。转化细胞和非转化细胞在非选择培养基上生长存在着竞争，而且往往非转化细胞在这种条件下生长更具优势，转化难以成功。一般在转化载体构建时就应该考虑后期转化细胞的选择问题。多在转化载体上加入一个选择标记基因。这样，在选择培养中加入选择试剂可以抑制非转化细胞的生长，而对转化细胞的生长无抑制作用，从而起到选择效果。

选择试剂的使用浓度，即选择压，应根据植物的特性来定，比较敏感的植物要用较低浓度的选择试剂。另外，一般选择试剂对植物材料有毒害，会影响植株的再生。倘若选用的某种植物中有很高的背景值，则需改换选择方案，所以在制定选择方案之前要先做抗生素敏感试验。

选择方法归纳起来有两种。第一种是先再生后选择，即在植株再生过程不加选择压，待植株再生后再进行选择。这种做法最大的弊端是嵌合体严重，假转化体多，后期选择困难。第二种是先选择后再生，即在转化后愈伤组织诱导或不定芽分化培养的一开始就加入选择剂。这种方法嵌合体少，假转化体少。

(二)高效转化体再生

转化体系的转化频率高低在很大程度上取决于转化体再生系统的优劣，而再生系统的主要因素是培养基。培养基的选择主要依据以下几个方面。

(1)供体植物的背景。在确定培养基时，首先要对供试植物的分类地位、生理特性、繁殖和栽培条件等有充分了解，这些资料是确定候选培养基的重要依据。特别应该了解供体植物对某种营养元素的特殊喜好。其次，应详细查阅前人对该种供试植物的研究工作，分析总结前人工作的成功和不足之处，在此基础上确定候选培养基类型。

(2)选择原则：①同一物种的培养基有类同性，同一植物不同组织器官的培养基相同；②组织培养所需营养成分与田间栽培有相似性；③无机盐浓度是选择的主要目标；④合适的蔗糖浓度、有机添加剂等。

(3)激素的选择要依据培养的目的，以及受体材料对各种激素的敏感性而定。

(4)植株的再生方式则依据物种及外植体类型而定。

二、各种农杆菌转化技术

(一)整株感染

一般采用种子实生苗、试管苗或活体组织器官(根、叶、花序)作为外植体，在整体植株上造成创伤，然后把农杆菌接种于创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植物体内，或进行沾根、沾花等使其进行侵染转化。模式植物拟南芥的花序农杆菌转化法是该种方法的典型代表。这种方法充分利用了实生苗的生长潜力，有很高的转化成功率。同时，不经过组织培养的过程，对于难以再生的植物是一条好的途径。但也有其不足之处，即有许多转化逃逸的细胞，给筛选造成困难。

(二)叶盘法

叶盘法(组织器官法)是Monsanto公司的Horsch等于1985年建立的，应用于基因转化外植体，是双子叶植物较为常用的方法(图10-3)。一般是选取健康的无菌苗利用打孔器打出圆形的叶片，将刚打出的带有新鲜伤口的叶圆盘与农杆菌进行短期的共培养，农杆菌通过伤口使携带外源基因的T-DNA进入植物细胞，使外源基因整合进植物基因组中。叶片、叶柄、茎、子叶、子叶柄、下胚轴是目前应用最广的外植体，使用哪种外植体应根据不同的植物而定。

图10-3叶圆盘转化法(叶盘法)

(三)原生质体法

原生质体法是指将处于原生质体再生细胞壁时的原生质体与农杆菌一起培养，一段时间后进行除菌，培养在含抗生素的选择培养基上，筛选生长出转化的细胞克隆块。这种转化所得的转化体一般不会是嵌合体，但必须有原生质体再生的工作基础。现在利用农杆菌转化的外植体不断增多，如胚性愈伤组织、幼胚和体细胞胚。

(四)替代性转化法

替代性转化法是新西兰DISR和Massey大学的研究人员设计的一种方法。该方法不是把外源基因导入并表达在植物的本身，而是导入并表达于生活在植物体内的内生植物真菌里。一旦内寄生菌生活在植物里，则外源基因将会由于真菌菌丝体对发育种子胚珠的侵入而进行母性遗传。目前这种技术被认为是克服禾谷类作物遗传工程困难的一种方法。

三、根癌农杆菌转化的具体技术

目前研究和应用最多的是拟南芥、水稻和棉花的遗传转化技术，下面对这三个植物的转化技术进行详述。这三个技术经过多个实验室验证，目前是比较完善的体系。

(一)农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌菌株为EHA105，卡那霉素选择。转化过程如下所述。

(1)共转化农杆菌：于12: 00接菌于有YEP培养液的试管中，28℃, 300r/min摇过夜，约30h;翌日18:00将已摇活的菌按1:400转至含YEP+卡那霉素(Kan)+利福平(Rif)中培养，28℃, 300r/min约14h;翌日8:00测OD值，当菌液达到OD₆₀₀为1.5～3.0时，可收集菌体于离心瓶(灭菌)。用10％蔗糖(含0.02％高效有机硅表面活性剂)稀释至OD₆₀₀为0.8～1.0备用。

(2)先将开花期的拟南芥苗子浇透水，在转化之前把已经结荚的果英全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。

(3)将花序浸没到农杆菌菌液中30s左右，然后用真空泵抽真空。

(4)标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24h后，将植株立起，正常培养直至收获种子。

(二)农杆菌转化棉花下胚轴的方法

转化采用农杆菌介导棉花下胚轴法，农杆菌菌株为LBA4404，卡那霉素选择。转化过程如下所述。

1．农杆菌菌株的培养

挑取平板培养基(LB或YEB)上的农杆菌单菌落，接种于含卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L的LB或YEB液体培养液中。28℃振荡培养过夜到细菌生长到对数晚期。用TGL液体培养基稀释菌液，再振荡培养4h，将菌液稀释至OD₆₀₀值0.3～0.5。

2．无菌苗制备

棉花种子用硫酸脱去短绒，自来水洗掉种子表面的硫酸，晾干。用70％乙醇对种子进行表面消毒1min; 10％～15％过氧化氢消毒2～4h；用无菌水冲洗2次或3次；在无菌水中浸泡18～24h，待种子露白；在无菌条件下剥去种皮，种入种苗培养基(1/2MS+琼脂7g/L,pH5.8)中；25～28℃光下培养3～5d备用。

3．棉花外植体与农杆菌的共培养

选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，浸入稀释好的菌液中5～10min，然后取出胚轴段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放入共培养培养基上(MS+2.4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+琼脂7g/L, pH5.8，表面铺一层灭菌滤纸)，用封口膜封口。22～25℃共培养2d。

4．诱导愈伤组织及抗性愈伤组织的筛选

经共培养后的下胚轴段放入愈伤组织诱导培养基中(MS+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L)，在常规条件下(温度25℃、光照长度12h/d、光照强度20001x)培养2个月。然后在无菌条件下挑取愈伤组织少许进行PCR检测，检测结果为阳性的愈伤组织继续继代，非阳性的愈伤组织淘汰。获得棉花抗性愈伤组织的频率一般为50％～76％(资料略)。

5．愈伤组织的增殖继代

诱导出的抗性愈伤组织接入增殖培养基(MS+硝酸铵1.65g/L+葡萄糖30g/L+琼脂6.8g/L)中，常规条件下培养，每一个月继代一次，直到愈伤组织分化。在第一次和第二次转入增殖培养基后有部分愈伤组织褐化死亡，正常愈伤组织增殖也不快；第二次继代后，愈伤组织增殖速度才加快。

6．愈伤组织的分化

愈伤组织经继代几次后，部分愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基(MS+谷氨酰胺1.0g/L+天冬酰胺0.5g/L+葡萄糖30g/L+琼脂6.8g/L)中，进一步分化成胚状体，胚状体长成小植株时再转入大的三角瓶中，待根长到5～7cm时可进行移栽。

7．再生植株的移栽

低温移植法：蛭石洗净晾干，灭菌后待用。洗去再生小苗根部的培养基，栽到蛭石中，浇足营养液。栽好的再生苗放入控温22℃、控湿80％～85％的人工培养箱中5～7d，取出放入网室10～20d，再移栽到土盆或大田中。

(三)农杆菌转化水稻愈伤组织的方法

1.水稻愈伤组织的诱导

(1)种子消毒：种子先在70％的乙醇中泡30s，倒掉乙醇后用灭菌水冲洗3～5次，加入0.1％升汞溶液，泡10～20min，中间晃动三次。最后用灭菌蒸馏水洗4～6次，用灭菌滤纸吸干种子上的水分。

(2)接种：把种子平放在NB₀+2,4-D培养基上，25℃恒温暗培养约10d。

(3)愈伤组织继代：接种10d后，把种子上的愈伤组织剥下，接种到NB₀上。25℃恒温暗培养约21d。

2．根癌农杆菌与水稻愈伤组织的共培养

(1)农杆菌的准备：从-80℃冰箱中取出农杆菌涂到YEP培养基(10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)上，28℃培养2d，至长出单菌落。单菌落接种到YEP培养基(10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)中，在28℃，250r/min下摇菌至OD₆₀₀=0.5(一般摇6～8h)。再把摇好的菌以1/1000的比例接种到ABC培养基(A培养基+B培养基+C培养基+10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素)中，在28℃, 250r/min下摇菌至OD₆₀₀=0.8～1.0(一般摇一个晚上)。取摇好的菌液30mL，于25℃,3500r/min下离心40min，丢弃上清，再加入30mL AAM培养基重悬沉淀，再于25℃, 3500r/min下离心40min，丢弃上清，再加入30mL AAM培养基重悬沉淀，将农杆菌稀释到OD₆₀₀= 0.4用于侵染。

(2)共培养：选择松脆、生长状况良好且淡黄色的胚性愈伤组织，弄碎放入准备好的侵染液中，浸泡30min，中间摇动数次。倒掉菌液，接种于NA培养基上，25℃下暗培养2～3d，至愈伤组织被农杆菌包围。

3.抗性愈伤组织的选择与植株再生

(1)共培养愈伤组织的清洗：把共培养的愈伤组织置于三角瓶中，用灭菌水洗5次或6次，直至灭菌水完全变清为止，再加入灭菌水[含1000mg/L头孢霉素(200mg/L氨苄青霉素)于25℃, 120r/min下摇动3h]，然后把灭菌水倒掉，愈伤组织倒在灭菌的滤纸上吸干多余的水分，接种到筛选培养基S1 (2mg/L 2,4-D, 500mg/L头孢霉素、200mg/L氨苄青霉素、50mg/L潮霉素)上。25℃恒温暗培养一个月后转接到S2 (2mg/L 2,4-D,1000mg/L头抱霉素、50mg/L潮霉素)上以使抗性愈伤组织增殖，25℃恒温暗培养。

(2)预分化：把抗性愈伤组织接种到P培养基上。25℃恒温暗培养约20d。

(3)分化：把预分化好的愈伤组织移至R培养基上，28℃, 20001x光强、12h光照下培养至出苗。

(4)苗的驯化：把R培养基中已长根的苗移到1/2MS培养基上，28℃, 20001x光强、12h光照下培养。最后洗掉培养基，剪短根叶后可移栽到田中。