植物基因组中有很多保守的结构域，可根据这些保守序列设计特异引物，开发特定的分子标记。

(一)基于RGA的分子标记

迄今为止，来源于不同植物的20多种抗病基因已被克隆，分析结果显示，这些来自不同植物的不同抗病基因大都具有一些共同的保守序列，如富含亮氨酸重复(leucine-rich re-peat, LRR)、核苷酸结合位点(nucleotide-binding site, NBS)、丝氨酸／苏氨酸激酶(serine-threonine kinase, STK)等保守区域。或者说，在植物界，不同抗病基因可能具有一定的同源性。

抗病基因类似物(resistance gene analog, RGA)是根据抗病基因的保守氨基酸序列设计的简并引物进行PCR的产物，由此衍生出来的标记称为RGA标记。RGA既可以作为一种分子标记，其本身又是潜在的(候选的)抗病基因。因此，这种RGA扩增技术(又称同源序列法)是寻找新的抗病基因的一种有效手段。例如，Leister等(1996)根据拟南芥抗病基因Rps 2和烟草抗病基因N的高度保守的LRR序列设计引物，对马铃薯基因组DNA进行PCR扩增，获得了与已知抗病基因同源、与抗线虫病基因Grol和抗晚疫病基因R7完全连锁的DNA片段。Kanazin等(1996)根据来自亚麻的L6、烟草的N和拟南芥的Rps2等抗病基因的保守区域设计引物，扩增大豆DNA，至少得到9类RGA，其中一些被定位于大豆的已知抗病基因座位附近。

RGA标记可通过以下途径获得：①简并引物扩增产物克隆、测序确认为是RGA后，其相对应克隆可作为探针进行RFLP分析；②由于简并引物的扩增产物是很多片段的混合体，琼脂糖凝胶无法揭示其多态性，Chen等(1998)利用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对简并引物的扩增产物直接进行分离，可产生多态性标记；③简并引物的扩增产物克隆、测序后，根据所获得的序列设计特异引物，然后采用AFLP的分析手段进行标记的获得，酶切和加接头步骤与AFLP相同，预扩增和选择性扩增时一个引物来自于跟AFLP相同的引物，另一引物则是RGA特异引物；④NBS-profilling技术，由Van der Linden等于2004年发展。该技术的要点是先对基因组DNA进行酶切，然后加上特定的接头，之后用简并引物进行PCR扩增，扩增产物用高分辨力的凝胶电泳即可获得多态性标记。

(二)基于反转录转座子的分子标记

反转录转座子是真核生物中一类可移动因子，转座需经过由RNA介导的反转录过程而得名，可分为LTR反转录转座子和非LTR反转录转座子。反转录转座子以高拷贝在植物界广泛分布，可以通过纵向和横向分别在世代之间和不同种之间进行传递，同一家族的反转录转座子具有高度的异质性。因此，反转录转座子可作为一种分子标记。

基于反转录转座子的分子标记有以下几种。①序列特异扩增多态性(sequence specific amplification polymorphism, SSAP)，该技术由Waugh等(1997)根据AFLP改进而来。其基本流程的酶切、加接头和预扩增与AFLP相同，只是在进行选择性扩增时，除了一个接头同源引物外，另一个引物是根据反转录转座子的LTR末端保守序列而设计的。SSAP的多态性来源有三：限制性位点及其两侧序列的变异、LTR 5’末端的变异和反转录转座子插入位点的变异。第一类变异和AFLP所检测的变异一样，而后两种变异都是由于反转录转座子而产生。②反转录转座子间区扩增多态性(inter retrotransposon amplified polymor-phism, IRAP)，该技术由Kalendar等(1999)发明，用来检测反转录转座子插入位点间多态性的分子标记。其原理是根据反转录转座子的LTR包含的保守序列而设计引物，这些引物在PCR过程中可以与LTR反转录转座子的相应区域退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段；也可根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增。③反转录转座子一微卫星扩增多态性(retrotransposon microsatellite amplified polymor-phism, REMAP)，该技术也是由Kalendar等(1999)所发明，用来检测反转录转座子和微卫星之间多态性的分子标记。其原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转座子与最接近的微卫星间的片段。REMAP检测反转录转座子与简单重复序列之间的多态性(图12-16)。④基于反转录转座子插入的多态性(retrotransposon based insertion polymorphism, RBIP)，该标记是根据豌豆的反转录转座子PDRI而设计的。用PDR1的反转录酶基因片段对豌豆属的一个基因组文库进行筛选，找到包含有该反转录转座子的克隆，然后对其进行测序，得到了包括反转录转座子及其两侧序列的碱基顺序。反转录转座子一侧的序列设为A，另一侧设为E，反转录转座子的保守序列设为C。在没有反转录转座子存在的情况下，以A和E为引物，可以通过PCR扩增出产物；如果有反转录转座子插入该区域，则由于A和E之间距离太远而无法扩增出产物，此时以C和E作为引物，则可以扩增出条带。

图12-16REMAP示意图

高通量分子标记

单位点与多位点分析技术到目前为止还是难以协调一致的。多位点分析(RAPD,AFLP等)在技术上相当简单而高效，但存在显著的缺陷和局限性，如显性遗传方式无法准确估计等位基因频率、杂合度等，在分子进化、种群遗传等结果准确性要求比较严格的应用受到严重制约。而单位点标记(RFLP等)虽然分析结果可靠但工作效率却较低，不可能在大规模的遗传分析中广泛应用。在许多研究领域，包括QTL定位、系统演化、分子进化等都涉及大量的分子标记分析。因此，要求发展高通量的分子标记。

以凝胶为基础的分子标记可通过384孔PCR反应、多重PCR、多重点样及利用自动测序仪进行电泳检测等方法来提高通量。然而，这些方法仍不能满足在遗传育种中的少样本多标记或多样本少标记的需求。随着对基因组研究的不断深入，那些效率低的检测方法逐渐被摒弃，而操作会转向自动化和大规模化。例如，以DNA芯片的方式，同时进行几百个乃至上千个SNP的分析，这样就可以以高密度的多点单倍型的方式进行连锁分析。目前，很多商业公司都推出了能够进行高通量、大规模分析的SNP分析平台。除了SNP外，以芯片为基础的高通量分析平台还有SFP,DArT和RAD标记。

SFP是被标记的不同基因型的DNA与同一个高密度寡核苷酸芯片进行杂交，不同基因型DNA杂交信号的显著不同被检测为SFP ; SFP分析中，芯片上的寡核苷酸行使着探针的功能并被描述为不同的特征。SFP是非常高效的分子标记，玉米中利用SFP构建了包含34000个SFP位点代表11000个基因的图谱(Zhu et al. , 2006)，番茄中构建了包含8500个SFP位点代表6000个基因的图谱(Salmeron and Zhu, 2007)；此外，SFP在小麦、水稻、大麦等作物中都有很好的应用。

DArT是高通量的基于微芯片杂交的技术，在序列未知的情况下可同时分析几百个多态性位点。该技术已被证实可重复性强且廉价高效。DArT标记是特定基因组DNA或通过差异杂交开发的多态性片段，表现为双等位型显性或共显性。DArT技术首先要开发“发现芯片(discovery array)”用于鉴别多态性DArT标记。"discovery array"，开发于宏基因组(感兴趣的种质基因组的混合)并进行了复杂性去除从而降低重复序列；之后单个克隆扩增后点到玻璃片上制成“discovery array"。单个基因组的片段标记后与芯片杂交就可获得DArT标记。DArT标记已在水稻、大麦、小麦等作物中应用。

RAD标记是基于微芯片技术的检测全基因组单个酶切位点变异的标记。RAD分析时，首先要构建全基因组的RAD标签文库，用于与选择的微阵列进行杂交从而在一次分析中检测所有的酶切位点变异。其步骤包括：①特定限制性内切核酸酶酶切基因组DNA;②连接生物素标记的接头；③把连接后的DNA随机剪切成比酶切位点间平均距离更小的片段，留下含有酶切位点及接头的小片段；④把片段固定在链霉抗生素蛋自包被的珠子上；⑤用最初的酶酶切将DNA标签从珠子上释放出来。该过程可特异地分离限制性内切核酸酶酶切位点周围的DNA标签。不同样品的RAD标签与微阵列进行杂交可进行高通量的杂交图谱分析。RAD在模式生物中成功应用后，在高等植物中也得到成功应用。

尽管SNP等高通量的分子标记在作物中已经成功应用，但这些技术还是局限在少数基因组已经测序的作物。对基因组信息较少的作物，传统的以凝胶为基础的分子标记仍然是主要的分析手段。常见的分子标记及特点见表12-1。

表12-1主要类型的DNA标记的特点比较