每种物质有其特定的吸收光谱曲线，所以根据其特征波长下的吸光度可以确定该物质的含量，这就是分光光度定性、定量分析以及研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

图13-7为美国热电公司Evolution 220紫外-可见分光光度计，1.0nm的分辨率，双光束(double-beam)配置。在测量的过程中任何时候当样品发生变化，双光束分光光度计都能提供最准确的数据。在每一个数据点都是把样品对比参考光束(reference beam)进行测量，从而减少了因改变样品而对结果的影响。这对动力学研究、长时间过程的监测以及复杂样品的分析尤为有效。

1．实验方法的选择

紫外吸收光谱分析方法主要是依据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息进行测定。常用的紫外光谱附件有石英比色皿、智能恒温单池转换器、智能恒温八联池转换器、镜面反射附件、ISA-220附件(反射模式的ISA-220附件、透射模式的ISA-220附件)、积分球固体紫外附件等。

图13-7 Evolution 220紫外-可见分光光度计

快速开启顶盒：独特的配有开启按钮的滑动样品舱开启门为双手已无空闲的操作员提供了极大的方便。

光学汇聚(application focused beam geometry, AFBG)技术：AFBG技术能依照使用要求优化一些光学特性。Evolution 220系统的AFBG技术适用于固体样品、光纤以及微量池的应用。配合材料研究和光纤应用附件进行优化，可使这些附件发挥到最高的性能。另外，从Micro AFBG发出的高度集中的细小光束，能让80％的光线通过一个2mm×2mm光径的40uL微量池。

可屏蔽的样品检测器：很多附件是自己提供检测器的，因此可依照分析需要，使用额外独立的检测器。

样品舱：因不受环境光线影响，样品舱能够在测量的过程中打开，从而使分析工作具有多样化，更便利，并可以使用其他特定附件。

彩色触摸屏：利用内置计算机提供的强大操作控制功能，采用触摸屏本机控制的Evolution 201和220分光光度计，用手指便可以进行常规操作，还可采用手写笔、键盘和USB鼠标来执行更为复杂的操作。

键盘：仪器可由本机控制或计算机控制。集成的按键能够和INSIGHT软件之间进行信息传递。按下“Run"和“Zero/Baseline”按键即可进行测量。还可以通过其他四个可编程的按键，启动客户订制环境(CUE)软件及其他应用程序。

触发信号连接：触发信号能够帮助与外界进行互动。不管是需要一个触发信号输出以引导步骤中的其他部分，还是等待一个触发信号开始进行测量。

USB接口：可以通过USB接口外接计算机，从而通过INSIGHT软件进行仪器控制、数据分析以及存储。也可以通过带有USB接口的存储设备备份分析方法和数据，可以连接鼠标和键盘，或者通过这个接口连接打印机输出数据和报告。

单色仪：在保证波长准确的前提下，精密的单色器能够实现快速扫描功能。扫描速度从＜1nm/min到6000nm/min，有充分灵活的选择来获取实验数据。

汞灯端口：Evolution 201和220分光光度计是这类仪器中唯一提供汞灯校准附件的仪器。这个附件可提供全波长范围的波长准度和波长再现性的校准。在某些特殊的情况下，如需重做波长校准，可用此附件测量并存储校正数据。

闪烁氙灯光源：闪烁氖灯仅在进行测量的时候发出强烈的闪光。长效闪烁氙灯能够保证持续工作3年，具有使用成本低廉，维修间隔周期长，在可见光区和紫外区都具有很高强度的优点。最重要的是，闪烁氖灯不需要预热，能够适时进行测量。

2．仪器的操作步骤

(1)开机

顺序开启紫外-可见分光光度计电源(仪器开机后即进入自检)、计算机主机。

(2)启动软件

1)开启计算机主机开关后，计算机会根据配置进入Windows或Vista操作系统。

2)双击桌面“thermo insight”快捷键后，进入“thermo insight”工作站。

(3)仪器初始化

Evolution 220开机后即进入自检，5～10min后自检结束，仪器可由本机控制、计算机控制或者把本机控制和计算机控制结合起来。一般选择由计算机控制具体的操作：用触摸笔点击触摸屏界面的“thermo insight"软件的“system setting"→" system"→"instrument control"中的“computer"，完成仪器的控制由仪器本身到计算机的转换。进入计算机的thermo insight工作站界面后，仪器即可测试，不需预热。

(4)参数设定

计算机的“thermo insight"工作站界面上的“HOMO”菜单有四种相应的测试方法：Fixed, Scan, Quant,Rated。选择相应的测试方法，然后进入相应的“setting"菜单，设置相应的测试参数即可测试。

(5)光谱测定

1)空白的紫外光谱：一般紫外测试的样品不论是固体还是液体，都需要空白样的测试，液体用相应的溶剂作空白，固体测试透过或者反射紫外可见光谱都有相应的空白配件。打开样品室盖，将空白对照放入样品室的样品池，盖上样品室盖。点击“measure scan”菜单界面下的“baseline"，进行背景扫描。

2)样品的紫外光谱：若被测物质为液体则溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级，固体粉末则放入相应的固体粉末池连接积分球测试。

打开样品室盖，取出空白对照，将经适当方法制备的样品放入样品室的样品架上，盖上样品室盖。点击“measure scan"菜单界面下的“measure"，弹出对话框“confirm sample list”显示“sample number”确认后点击“continue”进行样品扫描。数据采集完成后，弹出“数据采集完成”窗口，点击“是”。

3)保存样品光谱数据：数据采集完成后，选择“file”菜单栏下“save work-book"，出现“enter workbook file name”窗口，输入保存文件名，点击“保存”。

样品的保存设置在“options”菜单下面的“data store”下，可以按要求设置。

4)测定下一样品的紫外光谱：重复(2)～(4)操作，如果体系相同则采用同一背景，体系不同则重复(1)～(4)操作。

(6)扫谱结束

取下样品池，小心取出盐片。洗去样品(注意不要用水洗)。然后于红外灯下用滑石粉及无水乙醇进行抛光处理。最后用无水乙醇将表面洗干净，擦干，烘干。

按要求将模具、样品架等擦净收好，石英比色皿或者积分球配件晾干收好。

(7)关机

1)选择“file”>“exit”，退出程序；

2)从计算机桌面的开始菜单中选择关机，出现安全关机提示。

3)关闭计算机电源。

4)关闭仪器电源。

3．样品测试的一般步骤

将待测样品放于样品池中。若样品是液体，溶解在适当的溶液中放入石英比色皿的智能恒温八联池转换器或者智能恒温单池转换器样品池中；若样品是固体则更换积分球配件，放在相应位置测量固体的透过或者反射紫外-可见光谱。

(1)积分球的实验原理

反射率代表从样品表面反射回来的辐射能量大小。其定义为

R(％)＝I/I_o×100(％) (13-4)

式中，I为反射的辐射强度；I_o为标准表面反射回来的辐射强度。

反射光谱的测定是在紫外-可见分光光度计上加一可进行反射操作的附件。光学积分球，一般将一根内径为60～150mm的铝棒切成两半，技术比较精细复杂，然后将其挖成空心球，在球的内壁上涂上硫酸钡或熏上二氧化镁。此时在球心放上被测试的样品，则在球内壁的任何地方的漫反射强度都相等，积分球内表面涂有高漫反射材料的BaSO₄，可以使反射能量均匀化，在球内任一给定点反射光的强度都与空间分布无关，而与样品的漫反射率成正比，这就是积分球的工作原理，如图13-8所示。

图13-8 (a)中两个对角镜用于反射从样品反射过来的光线。图13-8(b)是用于反射光谱测定的积分球附件。从单色器过来的双光束通过两个窗口进入积分球，照射在样品及参比上，反射光进入光电倍增管后交互测定样品及参比的漫反射。

图13-8积分球的工作原理

(2)使用积分球附件的注意事项

1)无论使用透过样品还是反射样品，都要使样品紧密贴紧积分球开口，如有间隙会使测量值产生误差；

2)如副白板表面被污染，可用细砂纸轻轻磨干净，并将副白板保存在干燥的容器中。

3)测试粉末样品时，禁止倒置以防止将粉末或粉尘引入积分球内。

4)不能用手触摸镜面。

5)当积分球不使用时，把积分球和反射筒(reflector)放回附件箱内。

6)清洁事项：对于镜片，用干燥清洁的压缩空气或氮气清洁；对于涂层表面，先用干燥清洁的压缩空气清洁，接着用蒸馏水洗净，再用压缩空气干燥；对于附上的灰尘，用细度为220～240目的砂纸除去，再用蒸馏水洗净，最后用压缩空气干燥。

(3)液体样品的测量

被测物质为液体的溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级，在进行定量测试时要精确计算加入的量，作为标准曲线或者判断化合物的一种手段。在进行大量样品测试时，可以用智能恒温八联池转换器代替智能恒温单池转换器快速进行紫外光谱测试。图13-9是智能恒温单池转换器和可屏蔽的样品检测器以及石英比色皿。可屏蔽的样品检测器可依照分析需要，使用额外独立的检测器。石英比色皿采用lcm石英吸收池，智能恒温单池转换器对于少量的样品测试方便快捷。

图13-9石英比色皿及吸收池、智能恒温单池转换器附件示意图

图13-10是智能恒温八联池转换器示意图。八联池联动对于大量的样品测试省时省力。

图13-10智能恒温八联池转换器

(4)固体样品的测量

固体样品的紫外测试用积分球配件进行测试。光散射物质存在于各种各样的样品中，如自然水样以及生物匀浆等。面对传统测量方法很难准确测量的散射物质以及浑浊溶液，Evolution 220系统都能轻松实现。Evolution 220分光光度计的积分球附件(ISA 220)通过收集并整合散射的光线，能够把这些很难测试的样品准确地测量出来。ISA-220积分球附件是在同类价格仪器中性能最为突出和优秀的。它是60mm直径的Spectralon (R)球和lomm硅光电二极管，以及一个专用的AFBG光学系统的组合，能提供连续和准确的数据。在传统实验中，因为溶液中的悬浮微粒而产生的散射光造成入为的高吸收读数。由于采用散射测量，可利用ISA-220积分球捕获所有的正向散射光，提高数据质量并减少测量误差。

在作为反射附件时，ISA-220附件安装在样品仓的右侧，从而能让样品位于测量光束的焦点处。还可以调整样品的位置，选择采用或者不用8度的角来测量全反射(SPIN)或者漫反射(SPEX)。采用较小的反射口，能够把单光束带来的误差最小化，选择INSIGHT软件中的自动纠偏功能，这种误差则基本上能被消除。ISA-220附件为科研和常规的反射测量提供了卓越的性能。ISA-220是为测量反射而设计的，样品正好完全在积分球光束的焦点上，此外为方便拿取样品采用了弹簧样品夹设计。

固体样品的测试一般分为测试固体样品的透射性能和反射性能，对于固体样品透射性能的测试，要求样品尽量透明成膜，对于不透明的固体一般做其反射性能测试。积分球及其配件如图13-11所示，(a)图右边带有数据接口的是积分球的主体部分，圆柱形的样品池或样品空白放在其左边带有弹簧夹的槽中进行测试。旁边的三个圆形配件从上往下分别是固体样品透射性能测试的空白标准、固体样品反射性能测试的样品池、固体样品反射性能测试的空白标准。

在测试固体样品的反射性能时，先测试空白标准，测试完成后，换入固体样品反射性能测试的样品池。固体样品反射性能测试的样品的制作方法如下：把待测固体在研钵中研磨成粉末，均匀地平铺在样品池表面，然后旋紧待测。固体样品透射性能测试的样品的制作方法如下：不同于固体样品反射性能测试，透射测试的空白标准是夹在积分球左边弹簧夹的槽中，待测样则放入积分球前段的光路上并且不取下空白进行测试。

图13-11积分球(a)及其配件示意图(b)