一.结构分析

被测物质的溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级。分析时的注意事项如下。

采用1 cm石英吸收池，测定时应以配制样品溶液同批溶剂为空白对照(另有规定除外)，在规定的紫外-可见波长范围内进行扫描，绘制波长-吸光度吸收曲线，以便于进一步进行结构分析。

注意：没有颜色的溶液在紫外光谱区没有吸收峰。

二.定量分析

紫外-可见吸收光谱法进行定量分析依据的是朗伯-比尔定律。该法不仅可以直接测定本身在紫外-可见光谱区有吸收的无机物和有机物，还可以通过适当的显色反应使被测物质生成在紫外-可见光谱区有强烈吸收的产物，从而进行定量分析。

1.测量条件的选择

(1)入射光波长的选择

定量分析时为了获得较高的测量灵敏度，入射波长应该选择被测物质的最大吸收波长。如遇干扰时，可选用灵敏度稍低，但能避免干扰从而进行定量分析的其他波长。如果无法获知被测组分的适宜定量分析的吸收波长，可通过对被测物质在紫外-可见光谱区的波长-吸光度吸收曲线，确定该物质的最大吸收波长，或适宜的定量分析测定波长。

(2)控制适当的吸光度范围

定量分析时其吸光度在0.3～0.7之间时测量精度较好，吸光度值最好不要超过0.2～0.8。可以从两方面提高测量精度：控制溶液浓度；选择不同厚度的吸收池。

(3)选择适当的参比溶液

如果显色剂和所用的其他试剂均无色，而且被测试液中又无其他有色离子存在，可用蒸馏水作参比；如果显色剂无色，而被测试液存在其他有色离子时，应采用不加显色剂的被测试液作参比溶液；如果显色剂和试剂均有颜色，可在一份试液中加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不与显色剂作用，然后按试液测定加入显色剂及其他试剂，以此作参比溶液。

2．显色剂及显色反应

用于分析的显色剂中，无机显色剂不多，主要有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢。有机显色剂种类繁多，可与金属离子生成极其稳定的螯合物。常用的有机显色剂包括磺基水杨酸、丁二酮肟、邻二氮菲、二苯硫腙、偶氮胂(铀试剂Ⅲ)、铬天菁 S、结晶紫等。

显色反应的类型有配位反应、氧化还原反应以及增加生色团的衍生化反应等，其中配位反应应用最广。

(1)显色反应一般应满足的要求

1)灵敏度高，反应的产物须在紫外一可见光谱区有强烈的吸光能力，即吸光系数ε大。

2)选择性好，干扰少，或干扰容易消除。

3)产物组成恒定，符合一定的化学反应式。

4)产物化学性质足够稳定，至少在测量过程中溶液的吸光度变化很小。

5)产物与显色剂的颜色差别大。

(2)影响显色反应的因素

1)显色剂用量：一般须加入过量显色剂，以保证反应尽可能进行完全。

2)溶液的酸度：①影响显色剂的浓度和颜色。不少显色剂是有机弱酸，因此溶液的酸度将影响显色剂的离解，并影响显色反应的完全程度；有许多显色剂具有酸碱指示剂的性质，更应注意选择适当的酸度条件。②影响被测离子的存在状态。有些金属离子，随着水溶液酸度的降低，除了以简单的金属离子形式存在外，还可能形成一系列羟基或多核羟基络离子，也可能进一步水解生成沉淀。③影响配合物的组成。某些生成逐级配合物的显色反应，酸度不同，配合物的配合比不同，色调不同。④显色反应的最适宜酸度，可通过实验确定。在不同酸度下测定被测物同一浓度的吸光度，以pH为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制A～pH关系曲线。曲线的平直部分(吸光度恒定)所对应的pH区间就是最适宜的酸度范围。

3)显色时间：根据实验结果选择合适的显色时间。

4)反应温度：根据反应的具体情况选择合适的反应温度。

5)溶剂：可根据实际情况加入适当溶剂。一般有机溶剂能降低有色化合物的离解度，提高显色反应的灵敏度。

6)溶液中共存离子的影响：如果共存离子本身有颜色，或能与显色剂等反应生成有色化合物，会使测定结果偏高。如果共存离子和被测组分或显色剂生成无色配合物，将降低被测组分或显色剂的浓度，从而影响显色剂离子与被测组分的反应，使结果偏低。消除干扰离子影响的常用方法有：控制溶液的酸度；加入合适的掩蔽剂；利用氧化还原反应改变干扰离子的价态；选择适当的波长；利用参比溶液消除显色剂和某些有色共存离子的影响；将被测组分与干扰离子分离。

3．实验操作技术

定量分析时其吸收度以在0.3～0.7之间为宜(除该品种已有注明外)。

1)在紫外区测定必须配对使用洁净的石英吸收池，量瓶、移液管均应校正、洗净后使用。

2)应正确取吸收池，装盛样品以池体的2/3～3/4为宜，手指应拿毛玻璃面的两侧，透光面要用擦镜纸由上至下擦拭干净，直至无溶剂残留。使用挥发性溶液时应加盖，吸收池放入样品室时应注意方向相同，用后用溶剂或水冲洗干净，晾干防尘保存。

3)规定的吸收峰±12nm内，采用1 cm石英吸收池，在规定的波长附近自动扫描测定或测几个点的吸光度以核对样品吸收峰位置是否正确，然后以吸光度最大的波长作为测定波长(除另有规定外，否则均应在±2 nm以内)。

4)样品一般应取2份进行平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。

5)对于大部分被测样品，使用2nm缝宽。仪器狭缝宽度的选用应小于样品吸收带的半宽度，否则测得的数值偏低，选择原则应以减少狭缝宽度时样品的吸收度不再增加为准。

三.比色皿的使用方法

1)拿比色皿时，手指捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

2)装盛样品以池体的2/3～3/4为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视透光面应完全干燥透明。吸收池放入样品室时应注意方向相同。

3)测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

4)清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸乙醇混合洗涤液(1:2，体积比)浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。

每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

四.溶剂效应

溶剂对紫外-可见吸收光谱也产生一定影响：一是极性影响吸收波长红移和蓝移，以及吸收强度和精细结构；二是溶剂本身有一定的吸收带，表13-1是紫外-可见吸收光谱分析中常用溶剂的最低波长极限，低于此波长时，溶剂吸收不可忽略。

表13-1溶剂的使用最低波长极限