3．共沉淀分离法

微量组分与主要组分进行分离时，如果使主要组分形成沉淀，由于共沉淀现象，往往会使微量组分的损失严重，分离效果差；如果使微量组分形成沉淀，则由于其浓度甚小，很难定量析出。在这种情况下，可以加人某种其他离子同沉淀剂形成沉淀，该沉淀作为载体，将微量组分定量地共沉淀下来，再进行处理，达到分离和富集的目的，这种方法称为共沉淀分离法(co—precipitationseparation)，所用的共沉淀剂也分为无机共沉淀剂和有机共沉淀剂。

(1)无机共沉淀剂

通常利用形成混晶共沉淀或利用无定形沉淀的表面吸附现象来选择载体。例如BaSO4和RaSO4易形成混晶，利用BaSO4作载体可使Ra²⁺形成BaSO4和RaSO4的混晶而共沉淀下来。对微量熏金属而言，难溶的氢氧化物和硫化物是常用的载体，它们比表面积大，吸附能力强，能将重金属的氢氧化物或硫化物定量地共沉淀。例如采用PbS作载体，可将1吨海水中仅1pg的金富集。但氢氧化物和硫化物选择性不高，很容易影响下一步测定。

(2)有机共沉淀剂

有机共沉淀剂的应用较多，它选择性高、分离效果好，可以将被分离组分定量地共沉淀下来，灼烧后挥发除去。共沉淀下来的组分留在残渣中，可以用酸或其他溶剂溶解后进行测定。有机共沉淀剂的作用机理是先把无机离子转化为疏水化合物，然后以相似结构的有机共沉淀剂将其载带下来。

如Ni与丁二酮肟在氨性溶液中生成难溶螯合物，但在Ni含量低时不能单独析出。若加入丁二酮肟二烷酯的乙醇溶液，由于丁二酮肟二烷酯难溶于水，故在水溶液中析出而将微量镍一丁二酮肟螯合物带下。这类共沉淀剂与被测组分和沉淀剂都不发生反应，而其他不与丁二酮肟生成难溶螯合物的离子也不被共沉淀，因此沾污少、选择性高。

又如在含有微量Zn²⁺的弱酸性溶液中，加入NH4SCN使生成Zn(SCN)^2-₄络离子，再滴加甲基紫，甲基紫阳离子与Zn(SCN)^2-₄络阴离子缔合形成难溶的三元络合物，甲基紫本身也与SCN^-形成难溶化合物，可以将此三元络合物定量地载带下来。这里，SCN^一甲基紫难溶化合物是共沉淀剂。

二、蛋白质的沉淀分离

在生物医药工业和中药现代化行业，作为传统分离手段的沉淀技术是指因理化因素的改变引起生化活性物质的溶解度降低，导致固体成相的现象。

目前，沉淀技术广泛应用于实验室和工业规模的蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质和黄酮、皂苷、氨基酸、有机酸、生物碱等生物小分子物质的回收、浓缩和纯化中。

沉淀技术可以分为盐析沉淀、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀、等电点沉淀、聚电解质沉淀、高价金属离子沉淀、絮凝和凝聚等。下面将以蛋白质沉淀为例，介绍沉淀技术的原理、各种沉淀方法的特点与选用原则，并同样适用于其他生物分子或有机化合物的沉淀分离。

1．蛋白质的特性

蛋白质按功能可分为活性蛋白与非活性蛋白。活性蛋白有酶、激素蛋白、运输和储存蛋白、运动蛋白、防御蛋白、病毒衣壳蛋白、受体蛋白、毒蛋白和控制生长与分化的蛋白等；非活性蛋白有胶原蛋白和角蛋白等。通常，大部分蛋白质可溶于稀盐、稀酸、稀碱溶液和水中，蛋白质在不同溶剂中的溶解度差异主要取决于其自身分子结构性质(如亲疏平衡值各不相同的氨基酸组成等内部影响因素)和溶剂的理化性质(如温度、pH值和离子强度等外部影响因素)。因此，可用不同的溶剂或缓冲液提取、分离、纯化蛋白质和酶。

凡质点大小在1～100nm范围内所构成的分散系统称为胶体。蛋白质分子的直径一般在2～20mn范围内，且蛋白质分子表面分布着与水分子结合的亲水氨基酸的极性R基。因此，天然蛋白质溶液得以保持稳定的亲水胶体性质，其稳定性取决于水化作用(水化膜的存在，能防止蛋白质分子相互碰撞而聚集)和电荷的排斥作用(两性解离，同性电荷相互排斥而使蛋白质无法聚集)。当改变蛋白质的质点大小、电荷情况和水化作用的强弱，将破坏蛋白质的稳定性，蛋白质就从溶液中沉淀出来，这就是蛋白质的沉淀作用。因此，在生物大分子的分离纯化中，常利用蛋白质的沉淀作用来分离和制备蛋白质和酶。例如，采用乙醇分级沉淀的方法分离血浆蛋白。

由于蛋白质是两性生物大分子电解质，在水溶液中，蛋白质表面存在不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区。蛋白质和氨基酸一样，既含有酸性的基团又含有碱性的基团，在特定的pH范围内能解离产生带正电荷或带负电荷的基团。对于某一特定蛋白质而言，当在某一pH时，其所带电荷正负相等(即静电荷为0)，这一pH值被称为蛋白质的等电点(pI)。通常，蛋白质处于等电点时，其电导率、渗透压、黏度及洛解度等性质均处于最低值。因此，可利用蛋白质的两性解离和等电点特性来沉淀蛋白质。

当天然蛋白质受到诸如加热、紫外线照射、X射线辐射和超声波处理等物理因素的作用或者强酸、强碱和有机溶剂等化学因素的影响后，由于氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使其生物学性质、物理化学性质改变。这种现象称为蛋白质的变性作用。变性蛋白质的理化性质均发生改变，最显著的是溶解度降低、黏度增大、分子扩散速度增大、渗透压降低、等电点改变、生物活性降低或丧失和易被酶水解等。因此，在制备酶制剂或生物活性物质时应防止蛋白质变性的发生。但蛋白质的变性作用可用于选择性变性沉淀中去除杂质。

综上所述，由于蛋白质周围的水化层和蛋白质分子间的静电排斥作用是防止蛋白质沉淀的两种屏障，因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度(∈电位),来降低蛋白质溶液的稳定性，从而实现蛋白质的沉淀。水化层厚度和∈电位与溶液性质(如电解质的种类、浓度、pH等)密切相关；所以，蛋白质的沉淀可采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法，如加入无机盐的盐析法、加入酸碱调节溶液pH的等电点沉淀法、加入水溶性有机溶剂的有机溶剂沉淀法等来实现。

2．盐析沉淀技术

盐析沉淀通常有加入沉淀剂(分批或流加)、沉淀物的陈化、沉淀物的收集(离心或过滤)等三个操作步骤。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。由于盐析沉淀的产物中盐含量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理(如膜分离、凝胶过滤或离子交换等)，才能进行后续的纯化操作(如层析或结晶)。

当向蛋白质溶液中逐渐加入电解质时，开始蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶；当继续加入电解质时，由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出憎水区域，憎水区域间的相互作用，使蛋白质的溶解度减小，蛋白质发生聚集而沉淀的现象，称为盐析。因而蛋白质的溶解度与离子强度的关系曲线上存在最大值，但是该最大值仅在较低的离子强度下出现，在高于此离子强度的范围内，溶解度随盐离子强度的增大迅速降低。

由于盐析现象还不能很好地从理论上进行解释，现在常用Cohn方程式lgs=β一KsI兑明，式中，S为蛋白质的溶解度(g／L)；，为离子强度(1／2∑miz2)；卢为常数，与盐的种类无关，但与温度和pH有关；K为盐析常数，与盐种类和蛋白质有关，与温度和pH无关。

因此，用盐析沉淀技术分离蛋白质时有两种常用方式：①在一定的pH及温度条件下，改变盐浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为β盐析，常用于蛋白质的粗提；②在一定的离子强度下，改变溶液pH及温度达到沉淀的目的，称为口盐析，常用于蛋白质的精制和纯化。

盐析沉淀的机理。盐析机理可归纳为如下三点：①中性盐在溶解时，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白质表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②中性盐在溶解后，盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③中性盐在溶解过程中，盐离子引起原本在蛋白质分子周嗣有序排列的水分子的极化，使水活度降低。

不同蛋白质对盐析的影响反映在Cohn方程中就是对β和Ks的影响。不同蛋白质的卢值不同；Ks值随蛋白质相对分子质量的增大或分子不对称性的增强而增大，即盐析沉淀结构不对称的高相对分子质量蛋白质所需的盐浓度较低。对于特定的蛋白质，影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类、浓度、温度和pH值。

在实际工作中，常采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质，以达到分离目的。但是，有时候各种具有不同的卢和Ks值的蛋白质混杂在某一体系中，若欲从该体系中分离纯化各蛋白质就不是那么容易了，必须组合采取K；盐析、届盐析和二次盐析的方法予以解决。

3．等电点沉淀

较低离子强度的溶液中蛋白质的溶解度较小，蛋白质在pH为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度最低的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀法。

等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质(如酪蛋白)，而对于亲水性很强的蛋白质(如明胶)，由于在水中溶解度较大，在等电点的pH下不易产生沉淀。虽然等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛，但与盐析法相比，等电点沉淀无需后继的脱盐操作，可直接转入后续的纯化阶段。

等电点沉淀操作需在低离子强度下调整溶液pH至等电点使蛋白质沉淀，由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故等电点沉淀操作中，多通过加入盐酸、磷酸和硫酸等无机酸调节pH。