4免疫学与仪器结合方法

近年来，随着黄曲霉毒素在食品中的检出标准越来越严格，很多人采取了免疫学与仪器结合的方法来检测黄曲霉毒素，发展了黄曲霉毒素的检测方法。

4.1免疫亲和柱净化荧光光度法

张艺兵等［18］提出了一种以免疫亲和柱净化结合荧光光度法检测黄曲霉毒素的新方法，此法利用抗原抗体——对应

的特异吸附特性，以黄曲霉毒素单克隆抗体为填充柱，特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，再以甲醇为流动相将结合的黄曲霉毒素洗脱下来然后通过溴溶液衍生，所得衍生物可发射荧光，再通过荧光光度计分析即可以测定毒素含量。此方法克服了TLC法和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、有异味的有机溶剂对操作人员造成身体伤害和污染环境的缺点，所需仪器设备轻便易携带，自动化程度高，操作简单，灵敏度可达1μg／kg，回收率在85％以上。一个样品只需10～15min便能直接读出测试结果，比传统方法快几个小时甚至几天时间。缺点是此法只能测定黄曲霉毒素的总量且

对试剂要求比较高，检测中药材黄曲霉毒素的含量时结果会出现一些假阳性。

4.2免疫亲和柱高效液相色谱法

免疫亲和柱（IAC）是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成。由于抗原抗体有一一对应的特异性吸附关系，所以IAC能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其它杂质通过柱子，使样品得以纯化，吸附的黄曲霉毒素可以被极性有机溶剂洗脱，再用HPLC法进行定量检测［19］，其优点是具有高度特异性，可除去绝大多数干扰物质，检测限达1ng／g，还具有快速、溶剂使用少、可以自动化和再生利用的特点。缺点是柱成本高，商品化IAC仅适合几种毒素，有时需要加预柱净化。

4.3多功能净化柱高效液相色谱法

Wilson和Romer［20］开发了独特的真菌毒素多功能净化(MFC)柱，MFC柱提供一种快速的一步萃取纯化方法，工作原理和操作过程与其它净化柱相反，它含有亲脂性(非极性)和电荷活性成分(极性)，当样品提取液通过柱时，MFC柱保留样品液中的干扰物质如脂肪、蛋白质类化合物和碳水化合物等，而待测组分黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，从而一步完成净化过程，除去90％的杂质，减少了传统净化方式淋洗杂质和洗脱待测样品的步骤，从而达到净化目的，这一点是IAC和普通SPE净化柱所不具备的，并且与IAC相比净化效果同样理想，回收率高，灵敏度高，检测限低。

5超光谱（HS）法

一直以来，黄曲霉毒素的检测都用化学方法，并且有些化学方法的检测结果非常准确，但是化学方法都要耗费大量

的检测时间，检测费用较高且损坏检测样品，所以研究一种快速、准确、无损样品的检测方法对粮食产业是至关重要的，超光谱法检测黄曲霉毒就是这样一种方法。它的原理是首先通过光源激发待测样品，再通过设备捕捉成像，然后对成

像进行特征抽取和特征排列，最后实现区别受黄曲霉毒素污染和未受黄曲霉毒素污染的样品。HaiboYao［21］等利用超光谱法分析了长波紫外线激发下的玉米粒的光谱BGYF响应，首先用中心激发波长为365nm的紫外线光照射检测样品，被检测到黄绿色荧光的玉米粒，手动挑选出来，结果显示，在500～515nm波长范围具有较强的黄绿色荧光发射光谱峰，选取500～515nm有较强黄绿色荧光的玉米粒作为阳性组，用高效液相色谱法测定，与正常组对比，呈黄绿色荧光成像的黄曲霉毒素浓度的平均水平浓度是5.114μg／g。这个实验证明了玉米只有在感染黄曲霉毒素多的时候才会发出黄绿色荧光，所以根据BGYF测量黄曲霉毒素的含量是不准确的。HaiboYao等［22］还发现感染黄曲霉毒素的玉米会发生峰偏移现象，受黄曲霉毒素感染高的玉米粒其光谱峰会向长波方向移动，未受感染或者感染率低的玉米粒光谱峰会向短波方向移动，并且受黄曲霉毒素感染高的玉米粒比未受感染的玉米粒光谱峰强度低。使用超光谱法和光谱角度映射分类法对样品测试，样品荧光强度不敏感但对峰的变化敏感［23］，对待测玉米以20，100ng／g为临界值做检测，分类精度为86％时有15％的假阳性率，88％时有16％的假阳性率，结果表明，超光谱法和光谱角度映射分类法可以对感染与非感染玉米进行分类。HaiboYao等［24］用中心波长为365nm的紫外光激发待测玉米，用最大相似率和二进制编码两种算法分别对临界值为20，100ng／g进行实验，并与HPLC检测结果进行对比，发现二进制编码比最大相似率分类精确，20ng／g和100ng／g的分类精度分别为87%，88%。Pearson等［25］发现在BGYF光很弱的时候利用该检测系统无法检测到BGYF。他用一个硅光电二极管光纤光谱仪通过辨别分析，利用光的反射比从含量小于10ng／g或者没有被污染的玉米中检测出受黄曲霉毒素污染大于100ng／g的玉米，分类精度达到96.6%。Kalkan等［26］在365nm的紫外灯下分析了285个榛子样品，在440～450nm该鉴别能力最强的谱带分类精度达到90%。MusaAta等［27］用超光谱法对红辣椒进行实验，选择卤素灯和紫外光两种光源进行对比，在对成像进行特征抽取时分为单独频带能量特征和连续绝对差异光谱波段能量两种，在成像的特征排列中用了最低冗余和最大相关性（mRMR）及多层感知器连接权重（MLP），并对单独频带能量特征和连续差异光谱波段能量使用了量子直方图矩阵方法，并与HPLC检测结果做了对比，最终实验结果表明光源采用卤素灯、特征排列方法采用MLP法的分类精度最高（达91%）。HaiboYao等［28］研究了窄频带光谱指数加速检测黄曲霉毒素的方法，原先因为受到发射响应的限制，成像的强度位准比较低，全部的检测结果持续时间很长，而窄频带光谱可以使这种情况得到改善。首先用归一化差异荧光指数（NDFI）、差异化指数（DFI）、荧光率指数（FRI）3个指数与多谱线成像系统进行比较，发现两个系统的NDFI指数有最好的相关性，然后用窄频带光谱对25g和1kg的样品分别做了临界值为20，100ng／g的实验，并与HPLC进行比较。25g样品20，100ng／g的分类精度为83.33%，85.26%；1kg样品20，100ng／g的分类精度为69.23%，95.73%。

6针对黄曲霉毒素B1的快速检测方法

因为黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中毒性最强的，所以随着对黄曲霉毒素研究的深入，产生了很多对其快速检测的方法。

6.1免疫亲和微柱检测法

免疫亲和微柱检测法的原理是试样提取液经过滤、稀释后，通过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱。黄曲霉毒素B1免疫亲和柱是由偶联有黄曲霉毒素B1抗体的免疫亲和微球填充而成的，而此抗体对黄曲霉毒素B1具有专一性，样液中黄曲霉毒素B1被抗体捕获，杂质随洗涤液流出微柱，再以甲醇将黄曲霉毒素B1洗脱，洗脱液采用荧光光度法根据黄曲霉毒素B1检测工作曲线测定黄曲霉毒素B1的含量。朱剑［29］等用免疫亲和微柱法对大米，油脂，玉米粉做了黄曲霉毒素的检测并与酶联免疫吸附法作了比较，发现两种检测方法的准确度和灵敏度都比较高，免疫亲和微柱法比ELISA的重复性好，对植物油中黄曲霉毒素B1含量检测结果准确可靠。ELISA一次可以检测多个样本，适于大批量样品快速筛选，免疫亲和微柱法一次只能检测一个样本，适于单一样品现场快速检测，都比较适合基层实验室推广使用。

6.2一步式金标试纸法

金标免疫层析(GICA)是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫诊断技术。一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法，快速检测试纸利用纳米金作为标记物，可在5～10min完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定。它不需进行结合标记物与自由标记物的分离，省去了繁琐的加样、洗涤步骤，不仅提高了检测速度，而且检测过程中无需处理试剂，真正实现了一步式检测［30］。Zhang等［31］利用一步式金标试纸法分析一个样品，用时不到10min。在金标免疫试纸法的应用过程中，孙秀兰等［32］研究了样品基质对试纸条信号灵敏度的影响，为消除这些影响提供了经验。邓省亮等［33］用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记为抗黄曲霉毒素B1。单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维

膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明，黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5ng／mL，检测时间为10min，批内和批间重复性100%，假阳性率和假阴性率均为0。

6.3时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)

TRFIA是超微量检测中一项新兴检测技术，灵敏度较放射免疫分析(RIA)高出3个数量级。TRFIA原理与ELISA一致，不同的是TRFIA采用了一种特殊的标记物，即3价稀土离子(Eu3+，Tb3+等)代替酶标记物或其它荧光物，用时间分辨荧光仪测定产物中的荧光强度，从而判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA利用稀土元素荧光波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，可大幅度提高分析的灵敏度。黄飚等［34］采用自制黄曲霉毒素B1全抗原和多克隆抗体，构建了一套较为完整的黄曲霉毒素B1－TRFIA检测平台，具有较好的分析稳定性，灵敏度达到0.0039μg／L，线性范

围0.0039～100μg／L。灵敏度和测量范围均超越了市场上常用的进口或国产酶联免疫检测试剂(分别为0.1μg／L和0.1～10μg／L)，经过多方面考核，各项指标符合标记免疫试剂的要求，对食品、饲料等样本检测效果均佳，具有很好的应用前景。

7结语

综上所述，黄曲霉毒素具有高的致癌、致畸性，因而受到全世界的广泛关注。在人们对食品安全的意识不断提高的今天，加强对黄曲霉毒素的监控和检测非常必要。纵观其发展趋势，主要有两个发展方向，即对现有方法的改进和新方法的开发。常用的检测黄曲霉毒素的方法，即薄层色谱法、酶联免疫法及高效液相色谱法，因检测速度慢、精确度低、检测费用高等原因而影响了对黄曲霉毒素监控的广泛性及检测的即时性，需要加以改进。传统检测方法的不足促使黄曲霉毒素快速、准确检测方法的研发，例如超光谱法，它是一种无侵入性，无损性，快速、准确检测黄曲霉毒素的新方法，已经使用它对花生，玉米，辣椒，坚果类等进行了黄曲霉毒素的检测，并且准确度较高，是以后发展的方向；还有像电子鼻法、生物传感器等方法还不完善，需要改进，未来这些方法的

发展会使快速、准确、安全的检测黄曲霉毒素成为可能。