20世纪60年代，抗生素开始用作畜禽饲料添加剂。近年来随着养殖业的迅速发展，为了治疗、预防动物疾病和促进其机体生长，相当一部分饲养者违规超量使用抗生素。抗生素滥用导致环境中抗生素残留已成为一个严重的生态问题［1–2］。抗生素经使用后，相当一部分以原物或代谢物的方式随粪便排出。抗生素大多为极性化合物，具有亲水、挥发性弱等特征，因而水体是抗生素类污染最重要的“汇”。目前已从地下水、河水、城市污水等多种环境水体中检出抗生素［3–4］。

分属于四环素类的四环素（TC）、土霉素（OTC）及分属于大环内酯类的罗红霉素（ROX）是常用的抗生素类药物。目前，测定上述抗生素残留检测方法很多，大致分为3类，一是生物测定法，包括微生物测定法（microbiologicalassay）、放射受体测定法（redioreceptorassay）等；二是仪器分析法，包括波谱分析、紫外分析、荧光分析、高效液相色谱分析、气相色谱分析、液质联用分析等；三是免疫分析法，包括酶联免疫测定法（EIA，ELISA）、胶体金免疫层析法等［5–9］。其中测定四环素、土霉素及罗红霉素多用微生物法、酶联免疫法和液相色谱法，但这些方法存在特异性差、灵敏度低等缺点。液相色谱串联质谱法选择性高，特异性好，灵敏度高，且能最大程度地避免假阳性［10–12］。笔者利用固相萃取（SPE）浓缩净化，结合液相色谱串联质谱（LC–MS／MS）分析技术，采用外标法建立了同时检测地表水及城市污水中四环素、土霉素及罗红霉素残留的方法，测量精密度、准确度符合要求。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱三重四级杆质谱联用仪：UPLC–XEVO–TQMS型，美国Waters公司；全自动固相萃取仪：6位CaliperAutotraceSPE，美国Caliper公司；氮吹仪：EYELAMG–2200型，日本EYELA公司；乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国Merck公司；甲酸：色谱纯，美国Tedia公司；氢氧化钠、硫酸：均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司；Na2EDTA：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；四环素、盐酸土霉素、罗红霉素色谱标准物质：德国Dr.EhrenstorferGmbH公司；其它试剂均为分析纯；实验用水为蒸馏水或去离子水。

1.2仪器工作参数

1.2.1色谱条件

色谱柱：UPLCBEHC18型（50mm×2.1mm，1.7μm），美国Waters公司；柱温：40℃；进样体积：1μL；流动相：甲酸溶液（体积分数为0.01%）–乙腈，梯度洗脱程序见表1，流速为0.3mL／min。

1.2.2质谱条件

采用正离子电喷雾离子源（ESI+），多反应监测（MRM）模式。其相关质谱条件见表2。

1.3实验方法

固相萃取小柱依次用6mL二氯甲烷、6mL甲醇、6mLNa2EDTA溶液进行活化。将500mL水样加入0.5gNa2EDTA，调pH后过小柱，富集完成后用10mL水淋洗，氮吹20min，用10mL洗脱液分2次进行洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干后用初始流动相定容，过0.2μm膜进样分析。

2结果与讨论

2.1色谱条件优化

分别选择乙腈、甲醇与甲酸溶液配合作为流动相进行试验，结果发现使用甲醇作为流动相时，色谱图基线偏高，响应值偏低，而乙腈作为流动相时，色谱图基线稳定，响应值较高。

采用正离子电离模式进行质谱检测时，常使用具有一定酸度的流动相，以使目标物容易质子化而带正电荷，通过提高离子化效率增强检测的灵敏度。比较了0.01%，0.05%和0.1%的甲酸及纯水作为流动相对抗生素分离效果的影响，结果表明，0.01%甲酸分离效果最佳且目标化合物有较高的响应值，实验最终选择乙腈和0.01%甲酸混合溶液作为流动相。

2.2质谱条件优化

四环素类是两性物质，分子结构中同时含有酸性基团和碱性基团，电离时会同时产生正负离子。实验结果表明正离子采集的信号较强，因此以正离子方式（ESI+）进行采集。采用质量浓度为1mg／L的目标化合物标准溶液以Infusion的方式进行母离子全扫描，得到其准分子离子峰，然后分别以其准分子离子为母离子，通过氩气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高的碎片离子作为定性与定量特征离子，选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行碎裂电压及碰撞电压的优化，提高检测的灵敏度，优化后的参数见表2。

2.3固相萃取条件优化

SPE柱类型、洗脱剂和洗脱剂用量、上样体积和流速、pH等都会影响SPE萃取的效率，笔者以空白加标回收率为评价依据分别对这些实验条件进行了优化。

分别考察了HLB柱和普通C18小柱对目标化合物的萃取效果，HLB柱填充的是亲水、亲脂平衡的水可浸润型的反相吸附剂，研究发现，HLB对目标化合物的萃取效率远高于C18柱，因此选择HLB小柱对样品进行富集和净化。

比较了样品pH对提取效率的影响。发现提取效率在pH3时优于pH7时，因此水样和活化小柱所采用的Na2EDTA溶液均用1mol／L硫酸溶液调至pH3。

分别用甲醇、乙腈、酸化的甲醇（0.1%甲酸溶液）、乙酸乙酯、乙酸乙酯–甲醇（1∶4）作为洗脱液进行洗脱，发现使用酸化的甲醇洗脱效率最高且重现性好，因此洗脱液采用含0.1%甲酸的甲醇溶液。

上样流速分别为5，10，15mL／min时，发现空白加标的回收率在流速为5，10mL／min时没有显著差异，而在流速为15mL／min时回收率有明显下降，所以选择上样速率为10mL／min。

2.4标准样品色谱图

TC，OTC，ROX3种目标化合物标准样品的色谱图如图1所示。由图1可见，在1.2仪器工作条件下，3种目标化合物5min内即可实现良好分离。

2.5线性范围、检出限和精密度

将TC，OTC，ROX储备液（200mg／L）用初始流动相稀释至标准溶液系列（TC，OTC1.0～100μg／L，ROX0.1～10μg／L），按照1.2仪器工作条件进行分析。以定量离子对的响应面积与对应浓度进行线性回归得到标准曲线。目标化合物在此范围内具有良好的线性关系。以10μg／L的标准溶液（ROX1μg／L）重复进样7次验证仪器精密度，发现7次进样的相对标准偏差为1.4%～5.6%。以2～5倍基线噪音响应对应的浓度进行空白加标，以3倍信噪比（S／N）估算方法检出限，3种目标化合物的检出限介于0.08～0.35ng／L之间，其线性方程、相关系数、检出限见表3。

2.6水样分析及加标回收试验结果

在空白水样中分别添加目标化合物进行空白加标回收试验，采用外标法定量。为了考察不同的水体机制对实验结果产生的影响，同时进行了实际水样的加标回收试验，结果列于表4。由表4可知，TC，OTC，ROX3种目标化合物在空白水和实际水样中的加标回收率分别为82.5%～114%和71.5～126%，测量准确度能够满足实验的需要。

3结语

用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定水中的四环素、土霉素、罗红霉素，分析速度快，精密度、准确度良好，检出限低，适合快速检测各种水体中的抗生素类污染物。