1．基本原理

吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间吸附和溶解(解吸)能力的差异进行分离的色谱方法。

在给定温度下，在达到吸附平衡时，组分在流动相和固定相中的浓度(c_m和c_s)的比值称为吸附平衡的平衡常数(K_D)，也称为分配系数，用下式表示：

组分的性质不同，在固定相和流动相中的分配系数不同，分配系数大的组分在固定相上的吸附能力一强，在柱内移动速度慢，因而后流出色谱柱。由于各组分分配系数的差异，造成它们在色谱柱中移动速度的不同而在色谱柱上分离成不同的区带，这就是吸附色谱分离的原理。

2．吸附剂

吸附剂要有较大的比表面积和一定的吸附能力，有均匀的粒度，与洗脱剂和被分离物质不起化学反应。常用的吸附剂有氧化镁、氧化铝、硅胶、碳酸钙、硅酸镁、活性炭、聚酰胺、纤维素等。

氧化铝的吸附性源于表面存在的铝羟基，因生产条件不同又分为碱性、中性、酸性三种。硅胶的吸附性是由于硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键。聚酰胺由于分子内存在着很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而具有吸附作用。色谱用的聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末。

活性炭是一种非极性吸附剂，它的吸附主要由范德华力引起。它对非极性物质，尤其是芳香族化合物的吸附性特别强。可以在水溶液中吸附强极性化合物。

常用的吸附剂的性能及用途见表8-4。

表8-4吸附柱层析常用吸附剂

硅胶和氧化铝的吸附活性与含水量关系很大，含水量愈低，活性愈大，吸附力愈强。

3．流动相

流动相又称洗脱剂，流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。在氧化铝、硅胶等极性吸附剂上，非极性流动相洗脱作用弱，强极性流动相洗脱作用强。从有关的液相色谱书籍上可以查到各种溶剂的溶剂强度参数ε⁰。对于洗脱剂还要求黏度低，沸点低，以利于除去溶剂得到被分离组分。实际应用中可以采用单一溶剂或混合溶剂作为洗脱剂。对于极性差别较大的样品，可先用极性低的溶剂洗脱，以后逐渐增加洗脱剂的极性，此法称为溶剂梯度洗脱。为了减小羧基、氨基等强极性物质的拖尾，可在洗脱剂中添加少量乙酸(分离酸性物质)或氨水、二乙胺(分离碱性物质)。

①在氧化铝、硅胶吸附剂上混合溶剂的组合和洗脱顺序见表8-5。

表8-5用于氧化铝、硅胶吸附剂的混合溶剂

②在聚酰胺吸附剂上，洗脱剂的洗脱能力按下列顺序增强：水＜乙醇＜甲醇＜丙酮＜稀氨水＜稀氢氧化钠水溶液＜甲酰胺。

③在活性炭吸附剂上，溶剂的洗脱能力与硅胶等极性吸附剂相反，洗脱剂的洗脱能力按下列顺序增强：水＜甲醇＜乙醇＜丙酮＜正丙醇＜乙醚＜乙酸乙酯＜正己烷＜苯。

4．色谱体系选择

在极性吸附剂上，被分离物质的极性愈大，极性基团愈多，吸附力愈强，洗脱愈慢。常见的宫能团按极性增强的顺序排列如下：

对于某种试样，选择固定相和流动相的一般规律为：①弱极性组分选用吸附性较强的吸附剂，用极性较小的溶剂洗脱；②强极性组分用吸附性较弱的吸附剂，极性较大的溶剂洗脱，以便既能实现分离又能适时洗脱。可以用薄层色谱为柱色谱找流动相条件。

5．吸附柱色谱操作方法

色谱柱的直径与长度之比约为(1：10)～(1：30)，高度视分离的难易可作变动，底部塞以玻璃棉或脱脂棉，放一薄层海砂或石英砂。

(1)装柱装柱方法有干法、湿法两种。

①干法装柱选定吸附剂填料，粒径一般为0.07～0.15mm(100～200目)，筛分窄些较好。通过漏斗慢慢装入填料，每加一小部分，在实验台面上轻墩柱子，使其填实。装填完毕，在吸附剂表面铺一层滤纸或一薄层石英砂，使加洗脱剂时吸附剂不被冲起。然后从柱管口徐徐加入洗脱剂，打开下端活塞，保持一定流速，排除柱内气泡。液面要始终高于吸附剂。

②湿法装柱先在柱内加入洗脱剂，将下端活塞稍打开，同时将吸附剂缓缓加入柱内，加入的速度不宜太快，以免带入空气。可轻轻振动色谱柱，使带入的气泡从上部排出，并使填充均匀。

(2)加样溶解样品的溶剂极性应该与洗脱剂相近，以免影响分离。如试样难溶，可先将试样溶于适当的溶剂中，加入少量吸附剂拌匀；待溶剂挥发后，将吸附了试样的吸附剂加到柱床上端。

(3)色谱分离将洗脱剂小心地从柱顶端加到色谱柱中，控制一定的流速，流速一般在10～15mm/min。如因柱阻力大使流速过低，可在柱顶用惰性气体加压(或在柱出口抽真空减压)的方法调节。

如果分离的各个组分为有色物质，可依据看到的分离后的谱带，在柱后进行收集；如为无色物质，可以分别收集流出液采用薄层色谱、紫外光(能透紫外光的柱子，采用荧光吸附剂)及其它方法检测。

6．吸附柱色谱分离法的应用

柱色谱虽然费时，相对于仪器化的高效液相色谱分析法柱效较低，但由于有设备简单、容易操作、从洗脱液中获得的分离样品量大等特点，应用仍然较多。对于简单的样品用此法可直接获得纯物质，对于复杂组分的样品此法可作为初步分离手段，粗分为几类组分，然后再用其它分析手段，将各类组分进行分离分析。

例液化煤重馏分(沸程260～450℃)的分离。

取0.1～0.3g样品溶于数毫升氯仿中，吸附在3g中性氧化铝粉上，用干燥氮气流吹干。将样品加到装有6g中性氧化铝[0.177～0.074mm(80～200目)]，内径11mm的色谱柱上，依次用下列四种洗脱液洗脱，得到4种洗脱物：

①洗脱剂—20mL己烷；流出组分—脂肪烷烃。

②洗脱剂—50mL苯；流出组分—中性多环芳族化合物。

③洗脱剂—70mL氯仿(含0.75％乙醇)；流出组分—多环芳族含氮化合物。

④洗脱剂—50mL含10％乙醇的四氢呋喃；流出组分—羟基多环芳族化合物。

所得各类组分再结合硅胶柱色谱及仪器分析手段进行分离鉴定。