1．超高效液相色谱的理论基础

在高效液相色谱的速率理论中，范第姆特方程式的简化表达式：

如果仅考虑固定相的粒度d_p对H的影响，其简化方程式可表达为：

对由粒度d_p分别为101cm，5um、3.5um、2.5um和1.7um固定相填充的色谱柱，对同一实验溶质测定的范第姆特方程式的H-u曲线如图9-58所示。

图9-58  对应不同粒度d_P的H-u曲线

这些曲线表达了HPLC技术从20世纪70年代至2004年所取得的快速进展。随色谱柱中装填固定相粒度d_p的减小，色谱柱的H越小，色谱柱的柱效也越高。因此，色谱柱中装填固定相的粒度是对色谱柱性能产生影响的最重要因素。

具有不同粒度固定相的色谱柱，都对应各自最佳的流动相的线速度，在图9-58中，不同粒度的范第姆特曲线对应的最佳线速度为

由上述数据表明，随色谱柱中固定相粒度的减小，最佳线速度向高流速方向移动，并且有更宽的优化线速度范围。因此，降低色谱柱中固定相的粒度，不仅可以增加柱效，同时还可增加分离速度。

但是，应当看到在使用小颗粒的固定相时，会使△P大大增加，使用更高的流速会受到固定相的机械强度和色谱仪系统耐压性能的限制。然而，只要使用很小粒度的固定相，只有当达到最佳线速度时，它具有的高柱效和快速分离的特点才能显现出来。

因此要实现超高效液相色谱分析，必须制备出装填d_p<2um固定相的色谱柱。

2．超高效液相色谱固定相

随着表面多孔粒子的快速发展，其微型化也在迅速实现。市场上2009年已提供1.7um的表面多孔粒子(SPP)，并用于肽的分离。2013年又研制出1.3um和1.6um的SPP，这些亚-2um的粒子(1.3um、1.6um、1.7um)填充在2.1mm×50mm的色谱柱中，在超高效(或称超高压)液相色谱中操作，可获理论塔板数起过400000板/m的特高柱效，并已在超高效液相色谱分析中应用。

Waters公司使用“杂化颗粒技术”制成了全多孔球形1.7um的UPLC反相固定相，它保持与传统HPLC固定相相似的保留行为及样品容量，耐压超过140MPa(20000psi)，还优化了填料的孔径和孔体积，成为商品牌号为ACQUTY UPLCTM新型固定相，其立：体结构和杂化反应式如图9-59所示。

图9-59  ACQUITY UPLC^TM基本的立体结构和杂化反应式

3．超高效液相色谱仪器

要实现超高效液相色谱分析，UPLC仪器除必须装备d_p<2um固定相的色谱柱外，还需提供高压溶剂输送单元、低死体积的色谱系统、高速检测器、低扩散、低交叉污染的自动进样器以及高速数据采集、控制系统。

Waters公司的ACQUITY UPLC系统很好地实现了上述要求，与传统的HPLC比较，UPLC的分析速度是HPLC的5～9倍，检测灵敏度是3倍(分离度保持相同时)，分离度是1.7倍，UPLC系统已在生化分析领域获得越来越多的应用。

由于使用了优化的总体设计，ACQUITY UPLC系统实现了样品的高效、快速分析，图9-60为对同一样品，使用HPLC和UPLC进行分析获得的谱图，由谱图比较可明显看到UPLC在解决组成复杂样品分析的优越性，它具有的高效、快速和高灵敏，可大大提高分析工作效率。

图9-60  UPLC和HPLC分析结果比较

UPLC除具有上述优点外，还可通过电喷雾离子化接口与质谱仪连接，实现LC-MS联用或LC-MS/MS联用，并能解决复杂的生物样品的分析问题。

由前述对UPLC的简介中可以看到，正是当许多色谱工作者触及传统HPLC的分离极限时，UPLC却冲破HPLC的壁垒，使液相色谱的分离能力获得进一步的延伸和扩展。UPLC比HPLC提供了更高的柱效、分离度、灵敏度和更快的分析速度，从而为每次分析提供更多的信息，并大大提高色谱分析实验室的工作效率和分析质量。

随着UPLC技术的快速发展，现已有多家厂商生产此类仪器，可参见表9-21。

表9-21  UPLC仪器性能比较