一.制作校准曲线

(1)准备5个以上全量程范围内的标准溶液。按照分析操作说明所述对每个标准溶液进行操作。然后取一定体积的操作后标准溶液倒入仪器指定的干净样品池中。

(2)选择适当的波长。按照分析操作说明书，使用未经处理的原始样品或试剂空白对仪器进行调零。

(3)在分析操作说明书中要求的时间内测量并且记录这些标准溶液的吸光度。绘制吸光度对浓度的标准曲线。见下面吸光度对浓度的校准曲线的绘制方法”。

吸光度对浓度的校准曲线绘制的方法如下。

(1)测出吸光度之后，将结果绘制在坐标纸上。纵坐标是吸光度值，横坐标是浓度值。

(2)从下到上吸光度值递增，从左到右浓度值递增。坐标左下角的交叉点代表0.000吸光度和0浓度。从得到的曲线可以得到一张校正表，也可以直接从曲线上读出某吸光度对应的浓度值。还可以通过拟合得到的斜率和截距获得校准曲线方程。

另外，也可以利用哈希分光光度计里的用户自建程序功能，或曲线拟合软件(如Excle)来计算校准曲线。

二.使用其他分光光度计的操作流程

如果其他分光光度计的校准曲线也可以将吸光度转换为浓度，那么也可使用哈希的操作程序。不管什么型号的分光光度计，按照哈希操作程序准备样品和标准溶液，使用分析操作说明书中给出的最佳分析波长即可。

为给定的分析物制作校准曲线，需要准备和测量一系列的标准溶液。在坐标纸上绘制吸光度对浓度曲线(如前面吸光度对浓度的标准曲线的绘制方法)。用一条平滑的线连接曲线图上的点(弯或直线)。如果需要，利用曲线做一张校正表。

当开发新的分析流程，或使用对波长敏感的操作时，要选择仪器给出最佳吸收波长(见图3-2)。如果使用哈希公司的仪器和分析方法，通常不需要选择波长，因为哈希公司的预制程序一般选择了最佳分析波长进行分析。

图3-2  选择最佳分析波长

在分光光度计上选择最佳分析波长的步骤如下。

(1)参考仪器操作手册中关于波长调整的方法。

(2)选择单波长。

(3)输入一个合适的波长。

(4)准备样品和空白进行分析。将空白和反应后的样品溶液分别加入到合适的样品池中。

(5)把空白放到样品室中，调零。

(6)把准备好的样品放到样品室中，读取吸光度值。

(7)调整波长，至少增加100nm。按照步骤5再次调零，测量并且记录样品的吸光度值。

(8)重复调整波长，每次减少50nm。调零，测量并且记录每个波长下样品的吸光度值。在整个波长范围内进行以上重复步骤，记录吸收最大处的波长(参见表3-2)。

表3-2 例子(-)

(9)调整波长到比步骤(8)中得到的最佳分析波长增加50nm。按照步骤(5)再调零，测量并记录样品的吸光度值。然后以5nm步进减少波长重新测试。再调零，测量并记录每个波长下样品的吸光度。直到整个所关注的量程都进行了测量(见表3-3和图3-2)。

表3-3 例子(二)

选择最佳分析波长，测量含有低浓度和高浓度的两种样品溶液，检查确定这两种浓度的样品之间有足够的吸光度差异。由浓度的增加/减少所引起的吸光度变化取决于该分析方法的灵敏度。吸光度变化小的分析方法是不灵敏的，但是拥有较大的分析量程。吸光度变化大的分析方法是灵敏的，但是分析量程较小。