4.洗脱系统

HPLC的洗脱可分为洗脱溶剂固定洗脱(一种或几种固定溶剂组成的洗脱液，有人称之为等度洗脱)和梯度洗脱。梯度洗脱又可分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱两种。

1．洗脱溶剂固定洗脱(等度洗脱)

洗脱溶剂固定的洗脱(图2-29)一般是采用一种或几种固定混合的溶剂作流动相，对色谱柱进行洗脱，其优点是操作简单、使用成本低(只需要一个高压泵)。其缺点是分析速度慢(分析时间长)、分离效率差。目前的很多分析工作大多采用梯度洗脱。

图2-29 洗脱溶剂固定的洗脱

2．梯度洗脱

根据色谱分离理论，决定组分保留值的因素是分配系数和分配比；而分配比又叫容量因子(capacity factor)，它表征组分在固定相和流动相中分配量的比。梯度洗脱是使用一种或多种不同极性的溶剂作为流动相，在洗脱过程中不断改变流动相组分的比例，以此调节流动相的极性，使色谱柱流出物(样品)中的所有组分都有合适的分配比或容量因子，以保证能够在最短的时间内，达到分离的目的。梯度洗脱可以提高柱效，加快分析速度，缩短分析时间，并且可以改善HPLC系统中检测器的检测限，提高灵敏度。

梯度洗脱的优点：分离效率高、分析速度快；往往等度洗脱不能解决问题时，采用梯度洗脱就迎刃而解了。所以，梯度洗脱发展很快、使用非常广泛。

梯度洗脱又可以分为高压梯度洗脱和低压梯度洗脱。

(1)高压梯度。高压梯度洗脱又叫内梯度。国内外的HPLC系统绝大多数都配有高压梯度装置。如图2-30所示，高压梯度是由两台或三台高压输液泵A和B或C，将几种不同的溶剂，分别通过这几个高压泵A和B或C输入到混合室，溶剂在混合室经过混合后再进入色谱柱；样品经过进样器注入，经过色谱柱分离后进入检测器。这几种溶剂进入混合室的比例可以由计算机或溶剂程序控制器调节。高压梯度洗脱的优点是几台高压泵的流A可以独立控制，可以得到HPLC的使用者所需要的任何形势的梯度程序，容易实现自动化。

下面是高压梯度洗脱框图(图2-30):

图2-30 高压梯度洗脱示意框图

如图2-31所示是高压梯度装置示意图：

图2-31 高压梯度装置示意图

高压梯度系统的优缺点：

①梯度准确度好；

②梯度重复性好；

③不易产生气泡；

④但是其系统复杂(需两台或三台泵)，操作也比较复杂。

(2)低压梯度洗脱。

低压梯度洗脱又叫外梯度，是在常压下将两种或多种溶剂输入到混合器中，而后再用高压泵将流动相输入到色谱柱中。低压梯度洗脱装，框图如图2-32所示。

图2-32 低压梯度示意图

下面是低压梯度装置示意图(图2-33)

低压梯度洗脱系统的优缺点：

①系统简单，只需用一个高压泵；

②可以完全消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化引起的分析误差；

③需在线脱气机；

④但是存在时间滞后效应。

(3)洗脱液的脱气。洗脱系统中的洗脱液的脱气，也是一个特别值得注意的问题。因为，第一，如果气泡进入色谱柱，会严重损害色谱柱；第二，如果柱后压力下降，会使溶解在流动相中的空气自动脱出而形成气泡，这些气泡进入检测器后，会影响检测器的正常工作。在梯度洗脱时这种情况非常明显。所以，洗脱液的脱气非常重要。

图2-33 低压梯度装置示意图

目前国内外科技工作者使用的脱气方法大致有如下几种。

(1)在线自动脱气法。许多HPLC仪器都配备有在线自动脱气装置，它可以连续地从流动相中除去溶解的气体。该方法脱气效率高。

(2)超声波脱气法。一般是将溶剂瓶放到装有适量水的超声波清洗槽中，进行脱气。作者的实践证明，一般超声波脱气时30分钟时间足够，不必超很长时间。此脱气方法也经常被采用。

(3)低压脱气法。采用水泵抽真空、电磁搅拌、增加温度等方式脱气。此脱气方法不适用于梯度洗脱，所以使用不广泛。

(4)吹入惰性气体脱气法。向溶剂中吹入氦气等惰性气体，利用氦气的小气泡将溶入溶剂中的空气带出去。此法非常简便，适用性也广泛。但是氦气很贵，使用成本过高，故不宜推广。