3．色谱柱填料

HPLC从20世纪60年代问世以来，可以说是分析化学领域发展最快的技术之一。经过几十年的发展和完善，现在已成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品、卫生、环保检测和商检等领域不可缺少的检测和分离手段。由于生物大分子具有结构复杂、稳定性差、浓度低等特点，因此色谱分离技术几乎成为生物分子分离纯化的唯一手段。色谱柱毫无疑问是整个HPLC系统中的关键核心部件之一，而HPLC色谱柱的性能，很大程度上取决于色谱填料；色谱分析和分离技术重大进展往往是随着新的色谱分离材料技术的突破而出现的。

绝大部分的HPLC分析和分离材料都是在几种主要基质材料上衍生而来的。按基质的不同，填料可分为三大类，即以二氧化硅为代表的无机基质填料、以交联聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯为代表的合成高分子填料，以葡聚糖为代表的天然碳水高分子改性填料。在高效液相分析领域，二氧化硅(硅胶)及硅胶键合分离填料是应用历史最悠久也最为广泛的高效液相色谱填料，而合成高分子填料和天然高分子改性填料主要用于现代生物制药工业色谱分离纯化中。

据统计，硅质填料在色谱分析填料家族的应用方面占80％左右。硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面外，一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面化学键合和改性的基础，因此硅胶填料装填的色谱柱柱效高、分辨率高，可用于高效液相色谱分离。早期的硅胶是无定型的二氧化硅颗粒(图2-22)，主要是通过碾磨块状硅胶，然后通过筛分制备而成。这种色谱填料装成的柱子柱效低，稳定性和重复性差，只适用于较粗分析和分离。HPLC技术取得极大的进步得益于球形硅胶的出现(图2-23)，尤其是小粒径的球形硅胶(粒径＜10pm)的出现(图2-24)，极大地改善了色谱填料的性能，大幅度增大高效色谱的分离和分析能力，使得HPLC成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品、卫生、环保检测和商检等领域不可缺少检测和分离手段。

多孔二氯化硅微球作为色谱分离和分析材料的性能一般由其粒径大小、粒径分布、孔径，以及表面功能基团等决定。一般来说，粒径越小，柱效越高，分辨率也越高，但反压也越高，因此用于工业制备的色谱填料颗粒往往在10 um以上，常规HPLC色谱柱硅胶填料粒径在3～5um，而用于UPLC的色谱填料在2um以下。在其他条件相同的情况下，粒径分布越窄，柱效越高，反压也越低，重复性越好，粒径越小的色谱填料对粒径的均匀性要求越高。目前工业球形多孔氧化硅微球主要用溶胶一凝胶法(sol-gel)和喷雾干燥法制得；这两种方法适合于大工业制备各种尺寸大小的球形硅胶，但制备的粒径分布宽，不能直接满足色谱填料的需求。产品需要进行复杂的分级工艺去除大小不合格的硅胶。

国外大规模生产硅胶色谱填料的主要厂家是瑞典Chromasil，日本大曹(Daisol)和富士公司(Fuji)。近几年硅胶色谱填料的研制及产业化在国内进展也非常快。例如，江苏苏州园区的纳微公司，在江必旺博士的领导下，目前正在大力研发HPLC填料。他们首次利用独有的专利技术制备出均粒、高纯、全孔硅胶色谱填料(UniSilTM系列)，突破了单分散二氧化硅制备技术难题。该填料具有精确的粒径尺寸和高度均匀的粒径分布，是目前色谱技术应用的理想填料。中国纳微科技公司目前是世界上唯一一家可以规模化生产从1um到50um之间任意尺寸单分散硅胶填料的公司。

苏州纳微科技公司能生产高质量、高性能、种类齐全的硅胶基质色谱填料(图2-25)。常规硅胶色谱填料粒径大小分别有2um、3um、5um、8um、10um、13um、20um、30um、40um、50um；常规孔径可选择0.1nm(100)，0.12nm(120)，0.17nm(170)，0.3nm(300)，0.5nm(500)。该填料具有机械强度高、柱效高、分辨率高和反压低等特点，并已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模生产制备。

图2-25 纳微系列单分散多孔超纯硅胶色谱填料扫描电镜图

我国江苏苏州园区纳微科技公司的UniSilTM系列硅胶介质的特点如下。

(1)球形粒径高度均一。这一特点，会带来装柱容易、装好的色谱柱分辨率高。

(2)优化的孔径结构。可以带来高载量、高选择性。

(3)良好的封尾。这是一个很重要的特点，它可以使色谱柱耐碱性好，使用寿命长。

(4)无泄漏、无碎片。产品洁净，甚至可以延长色谱柱的寿命。

总之，我国纳微科技公司研发的色谱填料，突破了很多难关，取得了具有完美的球形和高度的粒径均一性，相对市场上粒径分布较宽的填料而言，具有装柱容易、反压低、柱效高、柱床稳定、分辨率高、流速均匀、柱通透性好等优点。同时，无碎片、无小颗粒的纳微填料也可避免筛板堵塞等问题。纳微UniSil硅胶填料与国外进口产品的扫描电镜对比如图2-26所示。

图2-26 纳微UniSil硅胶填料与国外进口产品的扫描电镜对比图

粒径分布与流速特征关系图如图2-27所示。

图2-27 纳微UniSil硅胶填料与国内外一般的色谱填料的粒径分布与流量特征关系圈

如图2-27所示：显然，由于纳微科技色谱填料具有完美的球形和高度的粒径均一性(右图)，所以，具有装柱容易、反压低、柱效高、柱床稳定、分辨率高、流速均匀、柱通透性好等优点。同时，无碎片、无小颗粒的纳微填料也可避免筛板堵塞等问题。

由于纳微科技色谱填料具有完美的球形和高度的粒径均一性，所以能够保证质量的稳定性和产品批与批之间的重复性。这是色谱工作者特别要重视的问题。

纳微公司开发的表面键合一封端技术，使纳微UniSilTM系列硅胶色谱填料具有更好的耐酸碱性，更优异的选择性能。

图2-28说明：包含吡啶(碱性化合物)在内多种物质的色谱峰尖锐、峰形对称、柱效高，说明纳微UniSil^TM 5-120 C18填料表面残留硅羟基少，封尾良好。

色谱条件：

色谱柱：UniSil^TM 5-120 C18，4.6×250mm

流动相：乙腈：水＝60：40

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

检测波长：UV＠ 254nm

样品：1．尿嘧啶；2.吡啶；3.苯酚；4.苯甲酸甲酯；5.N, N-二甲基苯胺；6.甲苯；7.乙基苯；8.p-二甲苯

图2-28 纳微的色谱柱使用效果(色谱图)

我国纳微科技是全球具备规模化生产硅胶和聚合物介质(填料)的极少数公司之一，是目前世界上唯一可以大规模生产均粒、超纯、全多孔硅胶色谱填料的公司，也是世界上能提供最全的单分散聚合物分离介质(聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯)的公司。纳微拥有世界领先的纳微米球合成及表面化学键合专利技术，可以保证生产的色谱填料具有高度的粒径均一性、精确的粒径大小、优化的孔径结构和比表面积，使其具有低反压、高选择性、高分辨率、高回收率、洗脱集中、重现性好等特点。纳微可规模化生产和提供硅胶、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯／二乙烯基笨为基质的三种性能互为补充的全系列色谱填料，涵盖了正相、反相、离子交换、疏水、亲和、体积排阻等色谱介质等，可满足从实验室分析到大工业规模分离的各种需求，如有机化合物、天然产物、抗生素、多肽、蛋白质、抗体、多糖和寡核苷酸等物质的高效分析和分离。纳微可提供从2 um到50um任意尺寸的无孔和有孔单分散高效色谱填料，常规孔径有0.1nm，0.3nm，0.5nm和1nm等规格。

相关链接：HPLC的色谱柱（一）