当向某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫作缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液、弱碱及其盐的混合溶液等都是缓冲溶液。

由弱酸及其盐所组成的缓冲溶液对酸的缓冲作用，是由于溶液中存在足够量的碱的缘故。当向这种溶液中加入一定量的强酸时，酸离子基本上被碱离子消耗，所以溶液的pH几乎不变；当加入一定量强碱时，溶液中存在的弱酸消耗碱离子而阻碍pH的变化。

缓冲液对HPLC的使用者非常重要，有时色谱峰分不开，加入适当的缓冲液，就能达到满意的结果。

1. 7.0～2.0范围内使用较多的酸性缓冲液配制方法

1.1 磷酸盐缓冲液(pH7.0)

取磷酸二氢钾0.68g加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1mL，用水稀释至100mL,即得。

1.2 磷酸盐缓冲液(pH6.5)

磷酸二氢钾0.68g，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液15.2mL，用水稀释至100mL,即得。

1.3 醋酸-醋酸铵缓冲液(pH6.0)

取醋酸铵100g，加水300mL使溶解，加冰醋酸7mL摇匀，即得。

1.4 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)

取醋酸钠18g，加冰醋酸9.8mL，再加水稀释至1000mL，即得。

1.5 枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)

甲液：取枸橼酸 21g或无水枸橼酸19.2g，加水使溶解成1000mL,置冰箱内保存。

乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000mL。

取上述甲液61.45mL与乙液38.55mL，混合摇匀，即得。

1.6 甲酸钠缓冲液(pH3.3)

取2mol/L甲酸溶液25mL，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L，甲酸溶液75mL，用水稀释至200mL，调节pH至3.25～3.30，即得。

1.7 醋酸-理盐缓冲液(pH3.0)

取冰醋酸50mL，加水800mL混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0再加水稀释至1000mL，即得。

1.8 磷酸盐缓冲液(pH2.5)

取磷酸二氢钾100g，加水800mL，用盐酸调节pH至2.5，用水稀释至1000mL。

1.9 磷酸盐缓冲液(pH2.0)

甲液：取磷酸16.6mL，加水至1000mL,摇匀。

乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶液成1000mL。

取上述甲液72.5mL与乙液27.5mL混合，摇匀即得。

2. 7.0～10.0范围内使用较多的碱性缓冲液配制方法

2.1 巴比妥缓冲液(pH7.4)

取巴比妥钠4.42g，加水使溶解并稀释至400mL，用200mol/L盐酸溶液调节pH至7.4过滤，即得。

2.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)

取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800mL,搅拌溶解，并稀释至1000mL，用6mol/L盐酸溶液调节pH至8.0，即得。

2.3 巴比妥缓冲液(pH8.6)

取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g，加水使溶解成2000mL，即得。

2.4 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)

取三羟甲基氨基甲烷6.06g，加盐酸赖氨酸3.65g，氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000mL，调节pH至9.0，即得。

2.5 氨-氯化铵缓冲液(pH10.0)

取氯化铵5.4g，加水20mL溶解后，加浓氯溶液35mL，再加水稀释至100mL,即得。

3. 缓冲液使用时应该特别注意的几个问题

(1)缓冲液使用前必须过滤。

(2)溶剂、样品易受到细菌和霉菌的影响，要注意清洁。

(3)一般不能直接用有机溶剂做清洗冲洗。

(4)梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液。

例如，梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐；在保证峰不拖尾的情况下，尽可能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐；缓冲盐浓度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高一点，一般为50～100mM。