作为一般原则，HPLC中使用的任何固定相都能用于TLC中。要使混合物得到很好分离，必须要根据被分离化合物的性质来选择合适的固定相。分离亲脂性化合物常选择氧化铝、硅胶、乙酰化纤维素及聚酰胺等。分离亲水性化合物常选择纤维素、离子交换纤维素、硅藻土及聚酰胺等。有时也有例外，如脂溶性叶绿素在氧化铝和纤维素上都能分离。在药品检验中，通常是按照药品标准中的具体规定选择相应的薄层板。

硅胶是最常用的吸附剂。普通硅胶是多孔性的无定形粉末，硅胶表面带有硅醇基而呈弱酸性，通过硅原子上的一OH基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附性能，由于化合物的极性及不饱和程度的不同形成氢键的能力不同而得到分离，有效的硅醇基越多，吸附能力越强。硅胶吸水形成水合硅醇基而降低吸附能力，但经150℃活化后，硅胶失去水分又可恢复活度，但若活化温度高于500℃，硅胶脱水失去群醇基，而大大降低活性。

硅胶分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。硅胶颗粒、孔径尺寸的选择可能是重要的分离因素。吸附剂颗粒小，展开速度慢，容易达到平衡．质量传递的阻滞可以忽略。用微粒吸附剂制成的高效薄层板在展开速度，点样数，定量精度，检出灵敏度及分离效率等方面比普通薄层板提高很多，因此高效薄层色谱法(HPLC)应用日益增多。但较大的孔径提供了更为非极性的吸附，大粒径的硅胶改善了较大的络合物分子的性能，可提供较大的样品容量。

硅胶颗粒(6—13μm)细小且稠密，具有光滑而均匀的表面，这种硅胶经酸洗、水洗至中性，经干燥将双取代羰基凝结为硅氧烷键。常加入5％一20％的硫酸钙半水化合物，即精炼的石膏(硅胶G)作为黏合剂，以提高吸附剂颗粒的黏合性，并增加吸附剂层与板的黏附性。如果石膏对某些类化合物的分离或它们的检测有干扰，则可使用专用的无机或不反应的有机黏合剂，使吸附剂层变硬以抗磨损。添加有机黏合剂如羧甲基纤维素钠的硅胶板更耐用，可承受大部分溶剂系统和任何展开试剂，而不会发生硅胶剥落或与试剂反应。当用强酸炭化显色，或者如果没有使用特殊的非反应性有机黏合剂时，可使用无机黏合剂。

当手工制备薄层板时，硅胶是以水匀浆的形式铺板的，大约是1.5～2份水对l份硅胶粉末。适当纯化后，硅胶很少或几乎不催化不稳定物质的反应性。TLC硅胶吸附剂的表面积一般为：300～500m2／g，孔径从4.0—8.0nm。

硅胶用来分离酸性或中性物质和具有相对低水溶性的混合物。为了使流动相的pH低于酸性溶质的pKa值，在流动相中加入弱酸(一般是乙酸)。在碱性硅胶吸附剂中加入特定的物质能够有助于某种被分析物的分离。这些添加剂可在制备板时加入到匀浆中，也可注入到板的固定相中。