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薄层扫描仪测光形式及扫描方式

发布时间:2014-07-08 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1280

不同型号的薄层扫描仪具有不同的测光方式,即使是同一台仪器有时也具有多种测光形式。总的来讲一般有以下几种类型。

(1)单波长扫描

单波长扫描是使用一种波长的光束对薄层进行扫描,又可分为单光束及双光束两种形式。

①单波长、单光束扫描仪 如岛津CS一920型(日本)、CAMAGII型(瑞士)、ZeissKM3型(德国)等均属这一类型的扫描仪。

单波长、单光束扫描仪对薄层厚度不均匀、显色不均匀或其他因素造成的背景不均匀等影响无法消除,因此采用此法时对薄层的要求较高,以求背景稳定、测得结果精度较好。Zeiss KM3型薄层扫描仪具有反射一透射装置,能抵消薄层背景波动的影响,改善测定精度。

②单波长、双光束扫描仪 光源发出的光经过单色器及棱镜系统分成两路均等的光束,一束光照在薄层板上被测斑点的部位,另一束光照在斑点附近的空白薄层上,记录两光束扫描所得吸光度之差。岛津CS一920型薄层扫描仪也是这种类型的仪器。

单波长、双光束扫描测定时由于测定值减去了斑点附近空白薄层的吸收,可以消除薄层背景不均匀的影响,而并非斑点本身所在部位,故不一定能全部抵消这种影响。

(2)双波长扫描

双波长扫描是采用两种不同波长的光束,先后扫描所要测定的斑点,并记录下两波长吸光度之差。两种波长的选择,需对欲测斑点进行原位光谱扫描,根据所测得斑点的吸收光谱选择最大吸收峰波长作为样品的测定波长(λs),选择斑点吸收光谱的基线部分,即该合物无吸收的波长为参比波长(λR)。

用双波长扫描,由于在(λS)扫描所得测定值中减去了(λR)扫描测定值(斑点所在处的空白薄层吸收值),薄层背景的不均匀性得到了补偿,扫描曲线的基线较为平稳,测定精度得到改善。具有双波长扫描功能的薄层扫描仪有两种形式。

①双波长、双光束薄层扫描仪如岛津CS一910型双波长薄层扫描仪,光源的光分成两路,通过两个分光器出来两束不同波长的光,一路用于测量样品,称样品波长(λS);另一路为参比波长(λR)。这两束光通过斩波器以一定频率交替照射到薄层的斑点上,测得结果为在此二波长的吸收度之差(△A),这样可以消除斑点处薄层背景的干扰,得到的基线明显改善。

②双波长、单光束薄层扫描仪如岛津CS一930型、CAMAG TLCⅡ型薄层扫描仪,其仪器结构是单波长、单光束的光路系统;是借助计算机程序来完成双波长扫描的。测定时斑点先经参比波长(λR)扫描一次,将测得值存储于计算机中,然后斑点再用样品波长(λS)扫描一次,计算机将两次测定值的差值计算出来并加以记录。这种构造的仪器只具一个单色器,仪器构造比较简单,但扫描需分两步进行,因此所需扫描时间较长。

扫描方式

根据扫描时光束(或光点)轨迹的不同,扫描有下述几种方式。

(1)直线扫描(线性扫描)

一定长度和宽度的光束照在薄层板的一端,薄层板相对于光束作等速直线移动至另一端。

进行直线扫描时光束应略长于斑点使整个斑点包括在内,并要使光束对准斑点中心。化合物在斑点各部位并非均匀分布,中心浓度大,光束通过斑点测得的是光束在各个部分吸光度之和。由于薄层扫描中吸光度与样品之间不呈线性关系,故外形不规则的斑点不适用直线扫描,因为光束若从不同方向扫描斑点,得到的吸光度积分值不同。

对于外形规则的斑点,采用直线扫描可以缩短测定时间。在进行斑点的荧光测定时一般只用直线扫描。

(2)锯齿扫描(曲折扫描)

用微小的正方形光束照射到薄层板斑点的前端,薄层板做x轴的等速直线移动及Y轴的等幅往复摆动,因此整个扫描过程呈锯齿状,光束的运动轨迹亦为锯齿形(CS一910型)或矩形(CS一930型)。

由于把光束缩小到使光束内斑点浓度变化可以忽略的程度,因此可以得到正确的测定值。这种扫描方式特别适用于形状不规则及浓度分布不均匀的斑点。

在扫描不规则斑点时,若从A或B不同方向扫描时,直线扫描所得到的峰面积积分值A与B的比值为2.7:1,相差较大;而锯齿扫描为0.95:1,基本一致。由此可见,锯齿扫描可以消除斑点分布误差。对一个不规则斑点采用上述两种不同方式进行扫描的结果比较。机械锯齿扫描仪(CS一930型)扫描速度慢,飞点扫描仪(CS一9000型)则克服了此缺点。

锯齿扫描的另一用途是薄层的背景补偿。若所测斑点位于薄层上背景吸收较强的部位,在锯齿扫描时,可用背景补偿装置从测得值中减去背景吸收值,得到更为准确的测定结果。其工作原理是在扫描时取扫描振幅范围外的一点作为背景补偿零点,用计算机将此零点测定值从斑点测定值中减去,以得到斑点的真正吸光度。

(3)圆形扫描

圆形扫描一般用于圆心式或向心式展开后所得圆形色谱的扫描测定。它还可分为径向扫描和圆周扫描,前者是光束由圆心向圆周方向扫描。后者是光束沿一定半径的圆周方向移动,光束长轴可与圆周一致,也可与圆周垂直。

(4)倾斜扫描

当展开通道发生倾斜时,扫描就应该沿倾斜后的通道进行。CS一930型扫描仪具有这种功能。

CAMAGⅢ型薄层扫描仪带有轨道优化软件,可以校正歪曲的展开轨道,使扫描结果更正确。

(5)多通道自动扫描

仪器提供的程序方式,可以完成多通道自动扫描。扫描前要设定7种参数,即波长λS及λR、扫描通道的X位置、通道Y方向的起始位置与终点位置、通道间距离以及一次自动扫描的通道数目。一次最多可扫描30个通道。每扫描完一个通道,最多可打印出10个色谱峰的峰面积。

显示、输出、控制方式

不同型号的扫描仪具有不同的显示输出方式,有的具条状显示窗显示波长、台坐标及吸收度等(如CS一930型);有的带有荧光屏,可显示各种参数与色谱、光谱图(如CS一9000型)。大部分仪器无板面显示,可外联记录仪(如CS一910型及ZeissKM3型)直接在记录仪上面出色谱图与光谱图。

CS- 910型薄层扫描仪在记录器一侧与Chroma—TopacC—EIB数据处理机连接,输入适当参数后,可记录被分离斑点的保留时问、峰面积及峰高,进行归一化法、外标法或内标法等定量计算。

CS一920型的数据处理机部分装在主机中,其参数及功能较少。

CS一930型在主机一侧连接数据处理机为本机专用的DR一2型,可完成参数的设定及数据处理以及报告打印及数据储存。

CAMAG薄层扫描仪由计算机工作站配合CATS软件控制操作,可帮助用户编制常规程式:扫描、积分、标准计算、斑点纯度对比及样品含量统计工作;可自动打印报告或以绘图仪绘制色谱:同时显示10个不同波长色谱,也可作双波长扫描;色谱档案功能:将斑点色谱图储存于计算机内,可随时与分析样品或标准作对比;全自动扫描功能:将常规工序编人程式内,扫描后自动积分及打印结果,适用于常规分析。

除上述常见的薄层色谱扫描仪外,还有一些专门的薄层色谱检测技术,如用于检测薄层上经放射性同位素标记物质的同位素检测扫描仪,扫描速度快、灵敏度高,也可用于凝胶片扫描,使薄层色谱法成功地用于生化和生物医学中常见的放射性同位素的研究。

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